7.25H: Análisis de Protección de ADN

La protección del ADN o análisis de “huella” es una técnica poderosa para identificar los nucleótidos involucrados en una interacción proteína-ADN.

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

Ilustrar el análisis de protección

PUNTOS CLAVE

Puntos Clave

• El análisis de protección de ADN es una técnica en la que una molécula de ADN se 'incuba' con una proteína que se une a un sitio específico a lo largo de la doble hélice.
• El complejo de proteína de unión al ADN se somete luego a digestión con endonucleasas de restricción, lo que reduce todo el ADN a fragmentos mono y oligonucleotídicos, excepto por la porción de la molécula de ADN que fue 'protegida' de la digestión por la proteína de unión.
• La eliminación de la proteína por medios químicos simples, por ejemplo, mediante electroforesis en gel, permite el estudio de la interacción del ADN y la proteína de unión.

Términos Clave

• electroforesis: un método para la separación y análisis de moléculas grandes (como proteínas) mediante la migración de una solución coloidal de ellas a través de un gel; electroforesis en gel
• reacción en cadena de la polimerasa: Una técnica en biología molecular para crear múltiples copias de ADN a partir de una muestra; utilizada en la toma de huellas genéticas etc.

La protección del ADN o huella es una técnica de biología molecular/bioquímica que detecta la interacción ADN-proteína usando el hecho de que una proteína unida al ADN a menudo protegerá ese ADN de la escisión enzimática. Esto hace posible localizar un sitio de unión a proteínas en una molécula de ADN particular. El método utiliza una enzima, desoxirribonucleasa (DNasa, para abreviar) para cortar el ADN marcado radiactivamente en los extremos, seguido de electroforesis en gel para detectar el patrón de escisión resultante. Por ejemplo, el fragmento de ADN de interés puede amplificarse mediante reacción en cadena de la polimerasa, siendo el resultado muchas moléculas de ADN con un marcador radiactivo en un extremo de una cadena de cada molécula bicatenaria. La escisión por DNasa producirá fragmentos, el más pequeño de los cuales se moverá más en el gel electroforético.

Figura: huella de ADN: protección de ADN o técnica de huella

Los fragmentos que son más pequeños aparecerán más en el gel que los fragmentos más largos. El gel se utiliza entonces para exponer una película fotográfica especial. El patrón de escisión del ADN en ausencia de una proteína de unión a ADN, típicamente denominada ADN libre, se compara con el patrón de escisión del ADN en presencia de una proteína de unión a ADN. Si la proteína se une al ADN, el sitio de unión está protegido de la escisión enzimática. Esta protección dará como resultado un área clara en el gel que se conoce como la “huella”. Al variar la concentración de la proteína de unión al ADN, la afinidad de unión de la proteína se puede estimar de acuerdo con la concentración mínima de proteína a la que se observa una huella. Esta técnica fue desarrollada por David Galas y Albert Schmitz en Ginebra en 1977.