7. 26B: Células de Seguimiento con Luz

La tecnología avanzada permite rastrear células con luz mediante la introducción de genes indicadores fluorescentes o luminiscentes en el genoma de las células.

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

Compare las formas en que la luz puede usar para rastrear celdas

CLAVES PARA LLEVAR

Puntos Clave

• La capacidad de rastrear células con luz ha revolucionado la biología molecular y ha proporcionado medios para estudiar los procesos biológicos a medida que ocurren.
• Las herramientas más comunes utilizadas para iluminar una célula son los genes indicadores fluorescentes (GFP) y luminiscentes (luciferasa).
• Los genes indicadores se introducen en el genoma del huésped y son controlados por la secuencia reguladora del gen bajo investigación (gen X). Así, cuando se expresa el gen X conducirá a lo largo de la expresión del gen informador y la célula emitirá fluorescencia o emitirá luz.
• Muchos dispositivos de laboratorio están disponibles para visualizar células vivas iluminadas y estos van desde microscopía de fluorescencia hasta espectroscopía más avanzada.

Términos Clave

• Espectroscopia: uso de luz, sonido o emisión de partículas para estudiar la materia. Las emisiones proporcionan información sobre las propiedades de la materia investigada. El dispositivo que a menudo se utiliza para dicho análisis es un espectrómetro, que registra el espectro de luz emitida (o absorbida) por un material dado.
• Microscopía de fluorescencia: microscopio óptico que utiliza fluorescencia para estudiar las propiedades de las sustancias. Una muestra se ilumina con luz de una longitud de onda que excita la fluorescencia en la muestra. La luz fluorescente, que suele estar a una longitud de onda más larga que la iluminación, se imagina luego a través de un objetivo de microscopio.

Fluorescencia y luminiscencia

Las células se someten a muchos procesos dinámicos. Para visualizar estos procesos necesitamos poder filmar celdas a lo largo del tiempo. Esto se puede lograr mediante el uso de herramientas para monitorear la expresión génica para rastrear cuándo se elaboran las proteínas y hacia dónde van en la célula. En biología molecular, los investigadores utilizan un gen reportero que adhieren a un gen regulador de interés. Los genes indicadores idealmente tienen propiedades distinguibles que pueden detectarse y medirse fácilmente. Los genes indicadores más utilizados tienen características biofluorescentes o bioluminiscentes y pueden visualizarse con la ayuda de microscopía y otros equipos de imagen no invasivos. Ejemplos de dichos indicadores son los genes que codifican la Proteína Verde Fluorescente (GFP) y la luciferasa, respectivamente. El descubrimiento de GFP cambió la forma en que vemos la vida celular hoy en día. GFP fue aislada por primera vez de la medusa (Aequorea victoria) por el científico japonés Osuma Shimomura a principios de la década de 1960. Posteriormente fue clonado y su secuencia identificada en 1992 por Douglas Prasher. GFP es ampliamente utilizado en laboratorios de investigación como una herramienta de marcado para iluminar y rastrear genes en células fijas o vivas. La luciferasa, aislada de luciérnagas, es una enzima presente en las células de organismos bioluminiscentes que cataliza la oxidación de luciferina y ATP produciendo luz. La luciferasa es igualmente útil como marcador biológico en células y organismos vivos.

Transfección de genes indicadores en células

Para introducir un gen reportero en un organismo, los científicos colocan el gen reportero y el gen de interés en el mismo constructo de ADN para insertarlo en la célula u organismo. Para bacterias o células procariotas en cultivo, esto suele estar en forma de una molécula circular de ADN llamada plásmido. Es importante utilizar un gen informador que no se exprese de forma nativa en la célula u organismo en estudio, ya que la expresión del reportero se está utilizando como marcador para la captación exitosa del gen de interés. La secuencia reguladora de este gen ahora controla la producción de GFP o luciferasa, además de la proteína de interés. En las células donde se expresa el gen, y se producen las proteínas etiquetadas, se producen GFP o luciferasa al mismo tiempo. Así, solo aquellas células en las que se expresa el gen marcado, o se producen las proteínas diana, fluorescerán cuando se observen bajo microscopía de fluorescencia, o bioluminiscencia (emiten luz) cuando se agrega luciferina, el sustrato para luciferasa.

Figura: Neuronas recién desarrolladas en el hipocampo del ratón adulto: Neurona piramidal visualizada por proteína verde fluorescente (GFP).

Figura: Introducción de un gen informador en una célula: Gen indicador utilizado como indicación de la expresión de la secuencia reguladora en la célula.

Aplicación de GFP en microbiología molecular

GFP tiene muchas ventajas sobre los genes informadores convencionales ya que es altamente estable, no tóxica para las células y organismos vivos, las herramientas de detección no son invasivas y la luz verde se genera sin la adición de cofactores externos y se mide sin la aplicación de equipos costosos. Se documentaron diversas aplicaciones de ese gen informador y varían desde ser capaz de monitorear la supervivencia de microorganismos en sistemas biológicos complejos como el lodo activado hasta la biodegradación de compuestos químicos en el suelo. GFP permitió la detección, determinación de ubicación espacial y enumeración de células bacterianas de diversas muestras ambientales como biopelícula y agua. GFP como biomarcador también es útil para monitorear la expresión génica y la localización de proteínas en células bacterianas.