7. 26C: PCR multiplex y en tiempo real

La PCR múltiple y en tiempo real son técnicas moleculares diseñadas para amplificar secuencias de ácidos nucleicos de manera cuantitativa.

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

Ilustrar el uso y método de PCR multiplex y en tiempo real

CONCLUSIONES CLAVE

Puntos Clave

• La PCR en tiempo real es una herramienta molecular para la amplificación de ácidos nucleicos monitoreada a medida que avanza la reacción.
• La técnica de PCR múltiple puede usar fluorescencia para detectar, cuantificar y visualizar productos de PCR en un monitor de computadora mediante la utilización de numerosos conjuntos de cebadores.
• La PCR en tiempo real puede ser una simple, amplificando un molde de ADN con un conjunto de cebadores, o múltiplex, amplificando uno o más moldes de ADN con uno o más conjuntos de cebadores en una reacción.

Términos Clave

• Electroforesis en gel de agarosa: Método utilizado para la separación de fragmentos de ADN por tamaño.
• oligonucleótido: Una cadena de ácido nucleico que sirve como punto de partida para la síntesis de ADN.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica molecular comúnmente utilizada para amplificar secuencias de ácidos nucleicos. El material de partida es un ARN mensajero (ARNm) de interés que podría obtenerse de una amplia gama de tipos de muestra y extraerse usando kits y reactivos disponibles comercialmente. Este ARNm se utiliza para sintetizar ADN complementario (ADNc) en una reacción catalizada por la enzima transcriptasa inversa. La importancia de este paso es que permite convertir un ARN lábil en su forma de ADNc más estable que puede almacenarse y usarse para múltiples aplicaciones. El ADNc resultante sirve como molde para la reacción PCR. El proceso de PCR se puede dividir en tres etapas: desnaturalización del ADN donde el ADN bicatenario (dsDNA) se separa a temperaturas superiores a 90°C, cebadores oligonucleotídicos que se hibridan a 50-60°C y extensión del cebador a 70—78°C. Un termociclador programable controla la velocidad de cambio de temperatura, la longitud del incubación a cada temperatura, y el número de veces que se repite cada ciclo de temperaturas. El producto final de la reacción se llama amplicón. Se confirma mediante electroforesis en gel de agarosa para obtener resultados cualitativos.

Figura: Termociclador: Aparato automatizado para amplificar secuencias de ADN usando la reacción en cadena de la polimerasa.

La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), también llamada PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), se utiliza para amplificar y cuantificar moléculas de ADN diana. El uso de RT-PCR permite tanto la detección como la cuantificación de secuencias de ADN. La cantidad puede ser un número absoluto de copias o una cantidad relativa cuando se normaliza a la entrada de ADN o genes normalizantes adicionales. El procedimiento para RT-PCR sigue los principios generales de la PCR, pero la característica definitoria es la capacidad de detectar ADN amplificado a medida que avanza la reacción en tiempo real.

La PCR en tiempo real puede usarse para amplificar moldes de ADN de baja abundancia. Es útil en el monitoreo del amplicón acumulado. Dos métodos comunes que se utilizan para la detección de productos en PCR en tiempo real incluyen el uso de colorantes fluorescentes no específicos que se intercalan con ADN bicatenario o sondas de ADN específicas de secuencia que consisten en oligonucleótidos marcados con un indicador fluorescente (oligosondas). El indicador fluorescente permite la detección después de la hibridación de la sonda con su diana de ADN complementario. Durante la PCR en tiempo real con oligosondas, hay un cambio en la señal tras la interacción directa con el amplicón. La señal está relacionada con la cantidad de amplicón presente durante cada ciclo y aumentará a medida que aumente la cantidad de amplicón específico. La detección de amplicón se pudo visualizar en una gráfica a medida que avanza la amplificación. Los ensayos de PCR en tiempo real han sido extremadamente útiles para estudiar agentes microbianos de enfermedades infecciosas y han demostrado ser valiosos para la investigación microbiológica básica. La capacidad de amplificar plantillas a partir de una amplia selección de especímenes lo ha convertido en un sistema ideal para su aplicación en las diversas disciplinas microbiológicas.

Figura: Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real: PCR en tiempo real utiliza sondas fluorescentes para medir la amplificación

Se introdujo una nueva y mejorada tecnología llamada PCR múltiple para permitir el uso de uno o más conjuntos de cebadores para amplificar potencialmente múltiples moldes dentro de una sola reacción. Se pueden ejecutar hasta 20 reacciones diferentes simultáneamente, por lo que se disminuye la cantidad de muestra utilizada, se reducen los reactivos consumidos y se recopila mucha más información por reacción, al tiempo que se simplifican los análisis de datos. La PCR múltiple es una aplicación desafiante que normalmente requiere más optimización que los ensayos estándar de PCR de amplicón único. La clave para una PCR multiplex exitosa es la capacidad de definir un único conjunto de parámetros de reacción (concentraciones de reactivos y parámetros de ciclado) que permita que todos los cebadores se hibriden con alta especificidad a sus secuencias diana y se extiendan con la misma eficiencia. El diseño del cebador, así como el sistema enzimático y tampón, son factores críticos en este desafío. Los resultados de la PCR múltiple pueden analizarse mediante electroforesis en gel o usando fluoróforos para el análisis usando durante la reacción. Idealmente, una PCR multiplex en tiempo real debería ser capaz de detectar, diferenciar y proporcionar un resultado cuantitativo para muchas dianas diferentes sin que una sola diana influya en la detección de una de las otras (cross-talk) y sin pérdida de sensibilidad. Es evidente que debido al número limitado de marcadores fluorofóricos disponibles y la superposición significativa en sus espectros de emisión, la cuantificación de los productos de reacción multiplex suele ser difícil.

Numerosas empresas han ayudado a superar este problema al poner a disposición colorantes que son compatibles para su uso en PCR multiplex. Desde su primera descripción en 1988 por Chamberlain et al, este método se ha aplicado en muchas áreas de las pruebas de ADN, incluyendo análisis de deleciones, mutaciones y polimorfismos, o ensayos cuantitativos y PCR de transcripción inversa. Por lo general, se utiliza para aplicaciones de genotipado donde se requiere análisis simultáneo de múltiples marcadores, detección de patógenos u organismos genéticamente modificados, o para análisis de microsatélites. Los ensayos multiplex pueden ser tediosos y requerir mucho tiempo de establecer, requiriendo largos procedimientos de optimización, pero una vez optimizados, se pueden lograr numerosos ensayos genómicos de alto rendimiento a una velocidad óptima.