4.3: Pruebas de Toxicidad
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4.3. Pruebas de toxicidad
Autor: Kees van Gestel
Crítico: Michiel Kraak
Objetivos de aprendizaje:
Deberías ser capaz de
- Mencionar los dos tipos generales de criterios de valoración en las pruebas de toxicidad
- Mencionar los principales grupos de organismos de prueba utilizados en toxicología ambiental
- Mencionar diferentes criterios que determinan la validez de las pruebas de toxicidad
- Explicar por qué las pruebas de toxicidad pueden necesitar un control negativo y un control positivo
Palabras clave: pruebas de toxicidad de una sola especie, selección de especies de prueba, relaciones concentración-respuesta, criterios de valoración, pruebas de bioacumulación, epidemiología, estandarización, control de calidad, transcriptómica, metabolómica,
Introducción
Las pruebas de toxicidad de laboratorio pueden proporcionar información sobre el potencial de los químicos para bioacumularse en los organismos y en su peligro, estos últimos generalmente se expresan como valores de toxicidad derivados de las relaciones concentración-respuesta. La Sección 4.3.1 sobre las pruebas de bioacumulación describe cómo realizar pruebas para evaluar el potencial de bioacumulación de sustancias químicas en organismos acuáticos y terrestres, y en condiciones de exposición estática y dinámica. Básico para las pruebas de toxicidad es el establecimiento de una relación concentración-respuesta, que relaciona el punto final medido en los organismos de prueba con las concentraciones de exposición. La Sección 4.3.2 sobre las relaciones concentración-respuesta elabora el cálculo de los parámetros de toxicidad relevantes como la concentración letal mediana (LC 50) y la concentración media efectiva (EC 50) a partir de dichas pruebas de toxicidad. También se discuten los pros y los contras de diferentes métodos para analizar datos de pruebas de toxicidad.
Hay que abordar varios temas al diseñar pruebas de toxicidad que permitan evaluar el peligro ambiental o para la salud humana de los productos químicos. Esto se refiere entre otros a la selección de organismos de prueba (ver sección 4.3.4 sobre la Selección de organismos de ensayo para pruebas de ecotoxicidad), medios de exposición, condiciones de prueba, duración de la prueba y criterios de valoración, pero también requiere criterios claros para verificar la calidad de las pruebas de toxicidad realizadas (ver más adelante). En la sección 4.3.3 sobre Puntos finales se discuten diferentes criterios de valoración del organismo completo que se utilizan comúnmente en las pruebas de toxicidad estándar, como supervivencia, crecimiento, reproducción o comportamiento de evitación. Los apartados 4.3.4 a 4.3.7 se centran en la selección y realización de pruebas con organismos representativos de ecosistemas acuáticos y terrestres. Esto incluye microorganismos (sección 4.3.6), plantas (sección 4.3.5), invertebrados (sección 4.3.4) y organismos vertebrados de ensayo (por ejemplo, peces: sección 4.3.4 sobre pruebas de ecotoxicidad, y aves: sección 4.3.7). Las pruebas de vertebrados, incluyendo peces (sección 4.3.4) y aves (sección 4.3.7), están sujetas a estrictas regulaciones, encaminadas a reducir el uso de animales de prueba. Por lo tanto, los datos sobre el peligro potencial de los productos químicos para la salud humana deben obtenerse preferiblemente de otras maneras, como mediante el uso de métodos de ensayo in vitro (sección 4.3.8), mediante el uso de datos de monitoreo posterior al registro de humanos expuestos (sección 4.3.9 sobre Pruebas de toxicidad en humanos ), o de análisis epidemiológicos en humanos expuestos (sección 4.3.10).
Inclusión de nuevos criterios de valoración en las pruebas de toxicidad
Tradicionalmente, las pruebas de toxicidad se centran en los criterios de valoración del organismo completo, siendo la supervivencia, el crecimiento y la reproducción los parámetros más medidos (sección 4.3.3). En caso de pruebas de toxicidad de vertebrados, también se pueden usar otros criterios de valoración que aborden los efectos a nivel de órganos o tejidos (sección 4.3.9 sobre pruebas de toxicidad en humanos). Los criterios de valoración conductuales (por ejemplo, el comportamiento de evitación) y bioquímicos, como la actividad enzimática, también se incluyen regularmente en las pruebas de toxicidad con vertebrados e invertebrados (secciones 4.3.3, 4.3.4, 4.3.7, 4.3.9).
Con el auge de la biología molecular, se han puesto a disposición nuevas técnicas que pueden proporcionar información adicional sobre los efectos de los químicos. Las herramientas moleculares pueden, por ejemplo, ser aplicadas en epidemiología molecular (sección 4.3.11) para encontrar relaciones causales entre los efectos en la salud y la exposición a sustancias químicas. Las pruebas de toxicidad también pueden usar respuestas de expresión génica (transcriptómica; sección 4.3.12) o cambios en el metabolismo (metabolómica; sección 4.3.13) en relación con exposiciones químicas para ayudar a desentrañar el mecanismo o mecanismos de acción de los químicos. Un desafío importante aún es explicar los efectos del organismo completo a partir de tales respuestas moleculares.
Estandarización de pruebas
La estandarización de pruebas es organizada por organismos internacionales como la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE), la Organización Internacional de Normalización (ISO) y ASTM International (anteriormente conocida como la Sociedad Americana de Pruebas y Materiales). La estandarización tiene como objetivo reducir la variación en los resultados de las pruebas al describir cuidadosamente los métodos de cultivo y manejo de los organismos de prueba, los procedimientos para realizar la prueba, las propiedades y composición de los medios de prueba, las condiciones de exposición y el análisis de los datos. Las pautas de prueba estandarizadas generalmente se basan en pruebas extensas de un método por diferentes laboratorios en una llamada prueba round-robin.
Los organismos reguladores generalmente requieren que las pruebas de toxicidad que respalden el registro de nuevos químicos se realicen de acuerdo con las pautas de prueba estandarizadas internacionalmente. En Europa, por ejemplo, todas las pruebas de toxicidad presentadas en el marco de REACH tienen que realizarse de acuerdo con las directrices de la OCDE para las pruebas de productos químicos (ver sección Regulación de productos químicos).
Control de calidad de las pruebas de toxicidad
Dado que las pruebas de toxicidad se realizan con organismos vivos, esto conduce inevitablemente a una variación (biológica) en los resultados. Hacer frente a esta variación requiere el uso de una replicación suficiente, diseños de pruebas cuidadosos y una buena elección de criterios de valoración (sección 4.3.3) para permitir estimaciones adecuadas de los datos de toxicidad relevantes.
Para controlar la calidad del resultado de las pruebas de toxicidad, se han desarrollado varios criterios, los cuales se aplican principalmente al desempeño de los organismos de prueba en los controles no expuestos. Estos criterios pueden requerir, por ejemplo, un% mínimo de supervivencia de los organismos de control, una tasa mínima de crecimiento o número de crías producidas por los controles y una variación limitada (por ejemplo, < 30%) de los datos de crecimiento o reproducción del control replicado (secciones 4.3.4, 4.3.5, 4.3.6, 4.3.7). Cuando las pruebas no cumplen estos criterios, el resultado es propenso a dudas, ya que por ejemplo una mala supervivencia de control dificultará sacar conclusiones sólidas sobre el efecto de la sustancia problema en este punto final. En consecuencia, las pruebas que no cumplan con estos criterios de validez pueden no ser aceptadas por otros científicos y por autoridades reguladoras.
En caso de que la sustancia problema se añada al medio de ensayo utilizando un disolvente, las pruebas de toxicidad también deben incluir un control de disolvente, además de un control regular no expuesto (ver sección 4.3.4 sobre la selección de organismos de ensayo para las pruebas de ecotoxicidad). En caso de que la respuesta en el testigo de disolvente difiera significativamente de la del control negativo, el testigo disolvente se utilizará como control para analizar los efectos de la sustancia problema. El control negativo solo se utilizará para verificar si se han cumplido los criterios de validez y para monitorear el estado de los organismos de prueba. En caso de que las respuestas en el control negativo y el control de disolvente no difieran significativamente, ambos controles pueden agruparse para el análisis de datos.
La mayoría de las pautas de prueba también requieren pruebas frecuentes de un control positivo, un químico con toxicidad conocida, para verificar si el cultivo a largo plazo de los organismos de prueba no conduce a cambios en su sensibilidad.
¿Cuáles son los principales criterios de valoración en las pruebas de toxicidad?
¿Cuáles son los principales grupos de organismos utilizados en las pruebas de toxicidad?
¿Por qué se requiere la estandarización de los métodos para las pruebas de toxicidad?
¿Qué elementos se incluyen en el control de calidad de las pruebas de toxicidad?
4.3.1. Pruebas de bioacumulación
Autor: Kees van Gestel
Revisores: Joop Hermens, Michiel Kraak, Susana Loureiro
Objetivos de aprendizaje:
Deberías ser capaz de
- describir métodos para determinar la bioacumulación de químicos en organismos terrestres y acuáticos
- describir un diseño de prueba adecuado para evaluar la cinética de bioacumulación de sustancias químicas en organismos
- mencionar los pros y los contras de las pruebas de bioacumulación estáticas y dinámicas
Palabras clave: bioconcentración, bioacumulación, cinética de absorción y eliminación, métodos de ensayo, suelo, agua
La bioacumulación se define como la captación de sustancias químicas en los organismos del medio ambiente. El grado de bioacumulación suele estar indicado por el factor de bioconcentración (FBC) en caso de que la exposición sea vía agua, o el factor de acumulación biota-a-suelo/sedimento (BSAF) para la exposición en suelo o sedimento (ver sección Bioacumulación).
Debido al riesgo potencial de transferencia de cadena alimentaria, generalmente se requiere la determinación experimental del potencial de bioacumulación de químicos en caso de alta lipofilia (log K ow > 3), a menos que el químico tenga una persistencia muy baja. Para productos químicos muy persistentes, la determinación experimental del potencial de bioacumulación ya se puede desencadenar en log K ow > 2. La determinación experimental de los valores de BCF y BSAF hace uso de sistemas de exposición estáticos o dinámicos.
En las pruebas estáticas, el medio se dosifica una vez con la sustancia problema, y los organismos se exponen durante un cierto periodo de tiempo después de lo cual tanto los organismos como el medio de prueba se analizan para determinar la sustancia problema. El BCF o BSAF se calculan a partir de las concentraciones medidas. Hay algunas preocupaciones con esta forma de pruebas de bioacumulación.
En primer lugar, las concentraciones de exposición pueden disminuir durante el ensayo, por ejemplo, debido a la (bio) degradación, volatilización, sorción a las paredes del recipiente de ensayo o absorción del compuesto de ensayo por los organismos de ensayo. Como consecuencia, la concentración en el medio de ensayo medida al inicio del ensayo puede no ser indicativa de la exposición real durante la prueba. Para tener esto en cuenta, las concentraciones de exposición se pueden medir al inicio y al final de la prueba y también en algunos momentos intermedios. Las concentraciones corporales en los organismos de prueba pueden relacionarse con las concentraciones de exposición promedio ponderada en el tiempo (TWA). Alternativamente, para superar el problema de la disminución de las concentraciones en los sistemas de ensayo acuáticos, se pueden aplicar sistemas de flujo continuo o técnicas de dosificación pasiva. Dichos métodos, sin embargo, no son aplicables a las pruebas de suelo o sedimentos, donde la transferencia repetida de organismos a medio recién agregado es la única manera de garantizar concentraciones de exposición más o menos constantes en caso de compuestos que se degradan rápidamente. Para evitar que la absorción de la sustancia problema en los organismos de ensayo conduzca a una disminución de las concentraciones de exposición, la cantidad de biomasa por volumen o masa del medio de ensayo debe ser suficientemente baja.
En segundo lugar, es incierto si al final del periodo de exposición se alcanza el estado estacionario o el equilibrio. Si este no es el caso, los valores resultantes de BSAF o BCF pueden subestimar el potencial de bioacumulación de la sustancia química. Para abordar este problema, se puede realizar una prueba dinámica para evaluar las constantes de tasa de absorción y eliminación para derivar valores de BSAF o BCF usando constantes de tasa de absorción y eliminación (ver más abajo).
Tales incertidumbres también se aplican a los valores de BCF y BSAF obtenidos mediante el análisis de organismos recolectados del campo y la comparación de las concentraciones corporales con los niveles de exposición en el ambiente. El uso de datos de organismos expuestos al campo, por un lado, tienen gran incertidumbre ya que no está claro si se alcanzó el equilibrio, por otro lado, reflejan la exposición a lo largo del tiempo en condiciones de exposición fluctuantes pero realistas.
Las pruebas dinámicas, también indicadas como pruebas de captación/eliminación o toxicocinéticas, pueden superar algunas, pero no todas, las desventajas de las pruebas estáticas. En pruebas dinámicas, los organismos son expuestos por cierto periodo de tiempo en medio de adición para evaluar la captación del químico, después de lo cual se transfieren a medio limpio para determinar la eliminación del químico. Tanto durante la fase de absorción como de eliminación, en diferentes momentos, se muestrean los organismos y se analizan para determinar la sustancia problema. También se muestrean frecuentemente el medio para verificar una posible disminución de la concentración de exposición durante la fase de captación. También en pruebas dinámicas, mantener las concentraciones de exposición constantes tanto como sea posible es un desafío importante, que requiere renovación frecuente (ver arriba).
Las pruebas toxicocinéticas también deben incluir controles, consistentes en organismos de prueba incubados en el medio limpio y transferidos a medio limpio al mismo tiempo que se transfieren los organismos del medio tratado. Dichos controles pueden ayudar a identificar posibles irregularidades en la prueba, como la mala salud de los organismos de prueba o la contaminación inesperada (cruzada) que ocurre durante la prueba.
Las concentraciones de la sustancia química medidas en los organismos de ensayo se representan frente al tiempo de exposición, y se ajusta a los datos un modelo de primer orden de un compartimento para estimar las constantes de absorción y eliminación. El valor (dinámico) de BSAF o BCF se determina entonces como la relación de las constantes de absorción y tasa de eliminación (ver sección sobre Bioconcentración y modelos cinéticos).
En una prueba toxicocinética, generalmente se toman muestras replicadas en cada punto del tiempo, tanto durante la fase de captación como en la fase de eliminación. La frecuencia de muestreo puede ser mayor al inicio que al final de ambas fases: en la Figura 1 se muestra un esquema de muestreo típico. Dado que el análisis de los datos toxicocinéticos utilizando el modelo de un compartimento se basa en regresión, generalmente se prefiere tener más puntos en el tiempo en lugar de tener muchas repeticiones por tiempo de muestreo. Desde esa perspectiva, a menudo no se utilizan más de 3-4 repeticiones por tiempo de muestreo, y 5-6 tiempos de muestreo para las fases de absorción y eliminación cada una.
Preferiblemente, las réplicas son independientes, por lo que se muestrean destructivamente en un punto de muestreo específico. Especialmente en ecotoxicología acuática, a veces se utilizan exposiciones masivas, teniendo todos los organismos de prueba en uno o pocos contenedores de prueba replicados. En este caso, en cada momento de muestreo se toman algunos organismos replicados del recipiente o recipientes de prueba, y al final de la fase de captación todos los organismos se transfieren a (a) recipiente (s) con medio limpio.
La Figura 2 muestra el resultado de una prueba sobre la cinética de captación y eliminación de molibdeno en la lombriz Eisenia andrei. A partir de la relación entre la constante de tasa de absorción (k 1) y la constante de tasa de eliminación (k 2) se pudo calcular un BSAF de aproximadamente 1.0, lo que sugiere un bajo potencial de bioacumulación de Mo en lombrices de tierra en el suelo ensayado.
Otra forma de evaluar el potencial de bioacumulación de sustancias químicas en organismos incluye el uso de productos químicos radiomarcados, lo que puede facilitar la detección de la sustancia problema. Sin embargo, el uso de productos químicos radiomarcados puede sobreestimar el potencial de bioacumulación cuando no se hace distinción entre el compuesto parental y los metabolitos potenciales. En el caso de los metales, los isótopos estables también pueden ofrecer una oportunidad para evaluar el potencial de bioacumulación. Dicho enfoque también se aplicó para distinguir el papel del Zn disuelto (iónico) en la bioacumulación de Zn en lombrices de tierra a partir de nanopartículas de ZnO. Las lombrices de tierra se expusieron a suelos enriquecidos con mezclas de 64 nanopartículas de ZnCl 2 y 68 ZnO. Los resultados mostraron que la disolución de las nanopartículas fue rápida y que las lombrices acumularon principalmente Zn presente en forma iónica en la solución del suelo (Laycock et al., 2017).
La Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE) ha publicado directrices estándar para evaluar la bioacumulación (cinética) de sustancias químicas para oligoquetos que habitan en sedimentos (OCDE, 2008), para lombrices de tierra/enquitraeidos en el suelo (OCDE, 2010) y para peces (OCDE, 2012).
Referencias
Diez-Ortiz, M., Giska, I., Groot, M., Borgman, E.M., Van Gestel, C.A.M. (2010). Influencia de las propiedades del suelo en la cinética de absorción y eliminación de molibdeno en la lombriz Eisenia andrei. Quimosfera 80, 1036-1043.
Laycock, A., Romero-Freire, A., Najorka, J., Svendsen, C., Van Gestel, C.A.M., Rehkämper, M. (2017). Nuevo enfoque de trazador multiisótopo para probar nanopartículas de ZnO y biodisponibilidad de Zn soluble en exposiciones conjuntas de suelo. Ciencia y Tecnología Ambiental 51, 12756−12763.
OCDE (2008). Lineamientos para las pruebas de productos químicos No. 315: Bioacumulación en Oligoquetos bentónicos que habitan en sedimentos. Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos, París.
OECD (2010). Lineamientos para las pruebas de productos químicos No. 317: Bioacumulación en Oligoquetos Terrestres. Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos, París.
OCDE (2012). Lineamientos para las pruebas de productos químicos No. 305: Bioacumulación en Peces: Exposición Acuosa y Dietética. Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos, París.
¿Por qué los valores de BSAF y BCF obtenidos de pruebas estáticas no pueden reflejar el potencial real de bioacumulación de los productos químicos, aunque fuera posible mantener constantes las concentraciones de exposición?
Describir el diseño experimental de una prueba para evaluar la cinética de absorción y eliminación de sustancias químicas en organismos de ensayo, en suelo o agua.
a. ¿Qué problema experimental se puede encontrar al determinar la bioacumulación de sustancias químicas en organismos terrestres o acuáticos?
b. ¿Y cómo se pueden superar estos problemas en el caso de los organismos acuáticos?
c. ¿Tal solución también es posible para los organismos terrestres?
4.3.2. Relaciones concentración-respuesta
Autor: Kees van Gestel
Revisores: Michiel Kraak, Thomas Backhaus
Objetivos de aprendizaje:
Deberías ser capaz de
- entender el concepto de la relación concentración-respuesta
- definir medidas de toxicidad
- distinguir los datos cuantales y continuos
- mencionar las razones para preferir los valores de ECx por encima de los valores NOEC
Palabras clave: efectos relacionados con la concentración, medida del efecto letal, medida del efecto subletal, análisis basado en regresión
El paradigma clave en la toxicología humana y ambiental es que la dosis determina el efecto. Este paradigma se remonta a Paracelso, afirmando que cualquier químico es tóxico, pero que la dosis determina la gravedad del efecto. En la práctica, este paradigma se utiliza para cuantificar la toxicidad de los químicos. Para ello se realizan pruebas de toxicidad en las que se exponen organismos (microbios, plantas, invertebrados, vertebrados) o células a un rango de concentraciones de un químico. Tales pruebas también incluyen incubaciones en medio control no tratado. La respuesta de los organismos de prueba se determina monitoreando criterios de valoración seleccionados, como supervivencia, crecimiento, reproducción u otros parámetros (ver sección Puntos finales). Los criterios de valoración pueden aumentar (p. ej. mortalidad) o disminuir con el aumento de la concentración de exposición (por ejemplo, supervivencia, reproducción, crecimiento). La respuesta de los puntos finales se grafica frente a la concentración de exposición, y se ajustan las llamadas curvas concentración-respuesta (Figura 1), a partir de las cuales se pueden calcular las medidas de la toxicidad del químico.
La unidad de exposición, la concentración o dosis, puede expresarse de manera diferente dependiendo del sujeto expuesto. La dosis se expresa como mg/kg de peso corporal en toxicología humana y después de eventos de exposición única (oral o dérmica) en mamíferos o aves. Para otros organismos expuestos por vía oral o dérmica (invertebrados), como las abejas melíferas, la dosis puede expresarse por animal, por ejemplo µg/abeja. Las exposiciones ambientales generalmente expresan exposición como la concentración en mg/kg de alimentos, mg/kg de suelo, mg/l de superficie, agua potable o subterránea, o mg/m 3 de aire.
En última instancia, es la concentración (número de moléculas del químico) en el sitio diana lo que determina el efecto. En consecuencia, se prefiere expresar concentraciones de exposición en base molar (mol/L, mol/kg), pero se aplica con menor frecuencia.
A concentraciones o dosis bajas, el punto final medido no se ve afectado por la exposición. Al aumentar la concentración, el punto final muestra una disminución o aumento relacionado con la concentración. A partir de esta disminución o incremento, se pueden calcular diferentes medidas de toxicidad:
ECX/edX: la “concentración efectiva” resp. “dosis efectiva”; “x” denota el efecto porcentual relativo a un testigo no tratado. Esto siempre debe ir seguido dando el punto final seleccionado.
Lcx/LDx: igual, pero especificado para un criterio de valoración específico: letalidad.
EC50/DE50: la mediana de la concentración o dosis del efecto, con “x” establecida en 50%. Esta es la estimación más común utilizada en toxicología ambiental. Esto siempre debe ir seguido dando el punto final seleccionado.
LC50/LD50: igual, pero especificado para un criterio de valoración específico: letalidad.
Los términos LCx y LDx se refieren a la fracción de animales que responden (moribundos), mientras que los ECx y EDx indican el grado de reducción del parámetro medido. El ECX/EDx describe el rendimiento promedio general de los organismos de prueba en términos del parámetro medido (por ejemplo, crecimiento, reproducción). El significado de un LCX/LDx parece obvio: se refiere a la letalidad de la sustancia problema. El uso de ECX/edX, sin embargo, siempre requiere la mención explícita del punto final al que se refiere.
Los modelos de concentración-respuesta suelen distinguir datos cuánticos y continuos. Los datos cuánticos se refieren a respuestas restringidas (“sí/no”) e incluyen, por ejemplo, datos de supervivencia, pero también pueden ser aplicables a respuestas de evitación. Los datos continuos se refieren a parámetros como crecimiento, reproducción (número de juveniles o huevos producidos) o mediciones bioquímicas y fisiológicas. Una diferencia crucial entre las respuestas cuantales y continuas es que las respuestas cuánticas son respuestas a nivel poblacional, mientras que las respuestas continuas también se pueden observar a nivel de individuos. Un organismo no puede estar medio muerto, pero ciertamente puede crecer solo a la mitad de la tasa de control.
Los modelos de concentración-respuesta suelen ser sigmoidales a escala logarítmica y se caracterizan por cuatro parámetros: mínimo, máximo, pendiente y posición. La respuesta mínima a menudo se establece en el nivel de control o en cero. La respuesta máxima a menudo se establece en 100%, en relación con el control o el máximo biológicamente plausible (por ejemplo, 100% de supervivencia). La pendiente identifica la inclinación de la curva y determina la distancia entre la CE50 y la EC10. El parámetro de posición indica dónde en el eje x se coloca la curva. La posición puede ser igual a la EC50 y en ese caso se le denomina punto de inflexión. Pero esto de hecho se mantiene solo para una pequeña fracción de modelos y no para modelos que no son simétricos a la EC50.
En toxicología ambiental, los valores de los parámetros generalmente se presentan con intervalos de confianza del 95% indicando los márgenes de incertidumbre. Se utilizan paquetes de software estadístico para calcular estos intervalos de confianza correspondientes del 95%.
Los diseños de pruebas basados en regresión requieren varias concentraciones de prueba, y los resultados dependen del modelo estadístico utilizado, especialmente en la región de bajo efecto. A veces es simplemente imposible usar un diseño basado en regresión porque el punto final no cubre un rango de efectos suficientemente alto (generalmente se necesita un efecto > 50% para un ajuste preciso).
En caso de respuestas cuánticas, especialmente supervivencia, la pendiente de la curva concentración-respuesta es una indicación de la distribución de sensibilidad de los individuos dentro de la población de organismos de prueba. Para una población muy homogénea de animales de prueba de laboratorio que tienen la misma edad y tamaño corporal, se espera una curva de concentración-respuesta más pronunciada que cuando se utilizan animales recolectados en el campo que representan un rango más amplio de edades y tamaños corporales (Figura 2).
Además de los valores de ECx, también se pueden utilizar pruebas de toxicidad para derivar otras medidas de toxicidad:
NOEC/NOEL: Concentración o nivel de efecto sin observar
LOEC/LOEL: Concentración o nivel de efecto más bajo observado
NOAEL: Nivel de Efectos Adversos No Observados. Igual que el NOEL, pero enfocándose en los efectos que son negativos (adversos) en comparación con el testigo.
LOAEL: Menor Nivel de Efectos Adversos Observados. Igual que LOEL, pero enfocándose en efectos negativos (adversos) en comparación con el testigo.
Cuando los ECx se derivan por ajuste de curva, los NOEC y LOEC se derivan mediante una prueba estadística que compara la respuesta a cada concentración de prueba con la de los controles. El NOEC se define como la concentración de prueba más alta donde la respuesta no difiere significativamente del testigo. El LOEC es la siguiente concentración más alta, por lo que la concentración más baja probada a la que la respuesta difiere significativamente del testigo. La Figura 3 muestra los valores de NOEC y LOEC derivados de una prueba hipotética. Por lo general, se utiliza un Análisis de Varianza (ANOVA) combinado con una prueba post-hoc, por ejemplo Tukey, Bonferroni o Dunnett, para determinar el NOEC y el LOEC.
La mayoría de los datos de toxicidad disponibles son NOEC, por lo que son los valores más comunes que se encuentran en las bases de datos y, por lo tanto, se utilizan Desde un punto de vista científico, sin embargo, existen bastantes desventajas relacionadas con el uso de NOEC:
- Obtenido por prueba estadística (prueba de hipótesis) (en comparación con el análisis de regresión);
- Igual a una de las concentraciones de ensayo, de modo que no se utilicen todos los datos del ensayo de toxicidad;
- Sensible al número de repeticiones utilizadas por concentración de exposición y control;
- Sensible a la variación en la respuesta, por lo que para las diferencias entre réplicas;
- Depende de la prueba estadística elegida, y de la varianza (σ);
- No tiene intervalos de confianza;
- Hace difícil comparar los datos de toxicidad entre laboratorios y entre especies.
El NOEC puede, debido a su sensibilidad a la variación y al diseño de la prueba, a veces ser igual o incluso superior a la CE50.
Debido a las desventajas del NOEC, se recomienda utilizar medidas de toxicidad derivadas ajustando una curva de concentración-respuesta a los datos obtenidos de una prueba de toxicidad. Como alternativa al NOEC, generalmente se utiliza una EC10 o EC20, lo que tiene las ventajas de que se obtiene utilizando todos los datos de la prueba y que tiene un intervalo de confianza del 95% indicando su confiabilidad. Tener un intervalo de confianza del 95% también permite una comparación estadística de los valores de ECx, lo que no es posible para los valores de NOEC.
¿Cuáles cuatro parámetros describen una curva dosis-respuesta?
¿Cuál sería la unidad preferida de medidas de toxicidad (e.g. EC20 o CE50) que describa el efecto de una sustancia química sobre la supervivencia de invertebrados del suelo expuestos en un suelo de prueba estandarizado?
¿Por qué esperaría que el uso de una población de laboratorio sincronizada por edad de organismos de prueba resulte en una curva de concentración-respuesta mucho más pronunciada para los efectos sobre la supervivencia de un químico que una población recolectada en campo de individuos no sincronizados?
¿Por qué se prefieren los valores de EC10 sobre los NOEC cuando se utilizan los resultados de las pruebas de toxicidad para la evaluación del riesgo de sustancias químicas?
4.3.3. Puntos finales
Autor: Michiel Kraak
Revisores: Kees van Gestel, Carlos Barata
Objetivos de aprendizaje:
Deberías ser capaz de
- enumerar los criterios de valoración del organismo completo disponibles en las pruebas de toxicidad.
- motivar la importancia de los criterios de valoración subletales en las pruebas de toxicidad aguda y crónica.
- describir cómo se miden los criterios de valoración subletales en las pruebas de toxicidad aguda y crónica.
Palabras clave: Mortalidad, supervivencia, criterios de valoración subletales, crecimiento, reproducción, comportamiento, fotosíntesis
Introducción
La mayoría de las pruebas de toxicidad realizadas son experimentos a corto plazo de dosis altas, pruebas agudas en las que la mortalidad suele ser el único punto final La mortalidad, sin embargo, es un parámetro crudo en respuesta a concentraciones relativamente altas y, por lo tanto, a menudo irrelevantes desde el punto de vista ambiental. A concentraciones de tóxicos mucho más bajas y por lo tanto ambientalmente más relevantes, los organismos pueden sufrir una amplia variedad de efectos subletales. De ahí que las pruebas de toxicidad ganen realismo ecológico si se abordan criterios de valoración subletales además de la mortalidad.
Mortalidad
La mortalidad se puede determinar tanto en pruebas de toxicidad aguda como crónica. En las pruebas agudas, la mortalidad suele ser el único criterio de valoración factible, aunque algunas pruebas agudas tardan lo suficiente como para medir también los criterios de valoración subletales, especialmente el crecimiento. Sin embargo, en general, esto se restringe a las pruebas de toxicidad crónica, en las que se puede evaluar una amplia variedad de variables subletales además de la mortalidad (Cuadro 1).
La mortalidad al final del periodo de exposición se evalúa simplemente contando el número de individuos sobrevivientes, pero también se puede expresar ya sea como porcentaje del número inicial de individuos o como porcentaje del testigo correspondiente. La mortalidad creciente con concentraciones crecientes de tóxico puede representarse en una relación dosis-respuesta a partir de la cual se puede derivar la CL50 (ver sección sobre la relación concentración-respuesta). Si evaluar la mortalidad no es destructiva, por ejemplo si esto se puede hacer por inspección visual, se puede puntuar a diferentes intervalos de tiempo durante una prueba de toxicidad. Aunque las observaciones repetidas pueden requerir cierto esfuerzo, generalmente generan valiosos conocimientos en el transcurso del proceso de intoxicación a lo largo del tiempo.
Criterios subletales en pruebas de toxicidad aguda
En las pruebas de toxicidad aguda es difícil evaluar otros criterios de valoración además de la mortalidad, ya que los efectos de los tóxicos sobre los criterios de valoración subletales como el crecimiento y la reproducción necesitan tiempos de exposición mucho más largos para expresarse (ver sección Toxicidad crónica). La incorporación de criterios subletales en las pruebas de toxicidad aguda requiere respuestas rápidas a la exposición a tóxicos. La fotosíntesis de las plantas y el comportamiento de los animales son criterios de valoración elegantes, sensibles y de rápida respuesta que pueden incorporarse en las pruebas de toxicidad aguda (Cuadro 1).
Puntos finales de comportamiento
El comportamiento es un criterio de valoración poco estudiado pero sensible y ecológicamente relevante en las pruebas de ecotoxicidad, ya que cambios sutiles en el comportamiento animal pueden afectar las interacciones tróficas y el funcionamiento de los ecosistemas. Varios estudios reportaron efectos sobre el comportamiento animal a concentraciones órdenes de magnitudes inferiores a las concentraciones letales. Van der Geest et al. (1999) mostraron que los cambios en el comportamiento de ventilación de larvas de quinto estadio de la caddisfly Hydropsyche angustipennis ocurrieron a concentraciones de Cu aproximadamente 150 veces menores que la mortalidad de larvas de primer estadio. El comportamiento de evitación del volutador anfípodo Corophium a sedimentos contaminados fue 1,000 veces más sensible que la supervivencia (Hellou et al., 2008). Chevalier et al. (2015) probaron el efecto de doce compuestos que cubren diferentes modos de acción sobre el comportamiento de natación de los dafnidos y observaron que la mayoría de los compuestos indujeron un aumento temprano y significativo de la velocidad de natación a concentraciones cercanas o inferiores a la concentración efectiva del 10% (48-h EC 10) de la prueba de inmovilización aguda. Barata et al. (2008) reportaron que el ensayo de inhibición de la alimentación de D. magna a corto plazo (24 h) fue en promedio 50 veces más sensible que las pruebas estandarizadas agudas al evaluar la toxicidad de una mezcla de 16 químicos en diferentes combinaciones de tipos de agua. Estos y muchos otros ejemplos muestran que los organismos pueden presentar un comportamiento alterado a concentraciones de tóxicos relativamente bajas y, por lo tanto, a menudo ambientalmente relevantes.
Las respuestas conductuales a la exposición a tóxicos también pueden ser muy rápidas, lo que permite a los organismos evitar una mayor exposición y bioacumulación y toxicidad posteriores. Una amplia gama de tales respuestas de evitación se han incorporado en las pruebas de ecotoxicidad (Araújo et al., 2016), incluyendo la evitación de suelo contaminado por lombrices de tierra (Eisenia fetida) (Rastetter & Gerhardt; 2018), inhibición de la alimentación de mejillones (Corbicula fluminea) (Castro et al., 2018), respuesta de natación aversiva a nanopartículas de plata por la alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii (Mitzel et al., 2017) y por dafnidos a doce compuestos que cubren diferentes modos de acción tóxica (Chevalier et al., 2015).
Fotosíntesis
La fotosíntesis es un punto final sensible y bien estudiado que se puede aplicar para identificar los efectos peligrosos de los herbicidas en productores primarios. En bioensayos con plantas o algas, la fotosíntesis a menudo se cuantifica mediante fluorometría de modulación de amplitud de pulso (PAM), una técnica de medición rápida adecuada para propósitos de cribado rápido. La fotosíntesis de algas se cuantifica preferiblemente en células adaptadas a la luz como eficiencia efectiva del fotosistema II (PSII) (ΦPSII) (Ralph et al., 2007; Skollema et al., 2014). Este criterio de valoración responde de manera más sensible a la actividad herbicida, ya que los herbicidas más comúnmente aplicados afectan directa o indirectamente al PSII (ver sección Toxicidad herbicida).
Criterios subletales en pruebas de toxicidad crónica
Además de la mortalidad, el crecimiento y la reproducción son los criterios de valoración más comúnmente evaluados en las pruebas de ecotoxicidad (Cuadro 1). El crecimiento se puede medir de dos maneras, como un aumento en la longitud y como un aumento en el peso. A menudo solo se determina la longitud o peso al final del periodo de exposición. Esto, sin embargo, incluye tanto el crecimiento antes como durante la exposición. Por lo tanto, es más distintivo medir la longitud o el peso al principio así como al final de la exposición, y luego restar la longitud o peso inicial individual o promedio de la longitud o peso individual final. El crecimiento durante el periodo de exposición podrá expresarse posteriormente como porcentaje de las longitudes o peso iniciales. Idealmente, la longitud o peso inicial se mide a partir de los mismos individuos que estarán expuestos. Cuando se sacrifican organismos para medir la longitud o peso inicial, lo que es especialmente el caso del peso seco, esto no es factible. En ese caso se desmonta una submuestra de los individuos al inicio de la prueba.
La reproducción es un punto final sensible y ecológico relevante en las pruebas de toxicidad crónica. Se trata de un parámetro integrado, que incorpora muchos aspectos diferentes del proceso, que se puede evaluar uno por uno. El primer parámetro de reproducción es el día de la primera reproducción. Este es un parámetro ecológicamente muy relevante, ya que el retraso en la reproducción obviamente tiene fuertes implicaciones para el crecimiento poblacional. El siguiente parámetro de reproducción es la cantidad de descendencia. En este caso se puede contar el número de huevos, semillas, neonatos o juveniles. Para los organismos que producen cuerdas de huevo o masas de huevos, se puede determinar tanto el número de masas de huevos como el número de huevos por masa. Por último, se puede cuantificar la calidad de la descendencia. Esto se puede lograr determinando su estado fisiológico (por ejemplo, contenido de grasa), su tamaño, supervivencia y finalmente su oportunidad o llegar a la edad adulta.
Cuadro 1. Los criterios de valoración del organismo completo se utilizan frecuentemente en pruebas de toxicidad. Quantal se refiere a un criterio de valoración sí/no, mientras que el grado se refiere a un punto final continuo (ver sección sobre la relación concentración-respuesta).
|
Endpoint |
Aguda/Crónica |
Cuantal/Calificadas |
|
mortalidad |
ambos |
quantal |
|
comportamiento |
aguda |
graduada |
|
evitación |
aguda |
quantal |
|
fotosíntesis |
aguda |
graduada |
|
crecimiento (longitud y peso) |
en su mayoría crónica |
graduada |
|
reproducción |
crónica |
graduada |
Una amplia variedad de otros criterios de valoración subletales de organismos enteros, menos comúnmente aplicados, se pueden evaluar tras la exposición crónica. Las posibilidades son infinitas, con algunos criterios de valoración específicos diseñados para el efecto de un solo compuesto solamente, o criterios de valoración específicos de especies, a veces descritos para un solo organismo. Los criterios de valoración de los suborganismos se describen en un capítulo separado (véase la sección Puntos finales moleculares en las pruebas de toxicidad).
Referencias
Araujo, C.V.M., Moreira-Santos, M., Ribeiro, R. (2016). Evitación espacial activa y pasiva por organismos acuáticos a partir de factores estresantes ambientales: Una perspectiva complementaria y una revisión crítica. Medio Ambiente Internacional 92-93, 405-415.
Barata, C., Alanon, P., Gutiérrez-Alonso, S., Riva, M.C., Fernández, C., Tarazona, J.V. (2008). Un bioensayo de alimentación de Daphnia magna como prueba de toxicidad subletal rentable y ecológica relevante para la evaluación del riesgo ambiental de efluentes tóxicos. Ciencia del Medio Ambiente Total 405 (1-3), 78-86.
Castro, B.B., Silva, C., Macario, I.P.E., Oliveira, B., Concalves, F., Pereira, J.L. (2018). Inhibición de la alimentación en Corbicula fluminea (OF Muller, 1774) como criterio de efecto a la exposición a contaminantes: Perspectivas para el cribado de ecotoxicidad y refinamiento del control químico. Toxicología Acuática 196, 25-34.
Chevalier, J., Harscoët, E., Keller, M., Pandard, P., Cachot, J., Grote, M. (2015). Exploración de perfiles de efectos conductuales de Daphnia inducidos por una amplia gama de tóxicos con diferentes modos de acción. Toxicología y Química Ambiental 34, 1760-1769.
Hellou J., Cheeseman, K., Desnoyers, E., Johnston, D., Jouvenelle, M.L., Leonard, J., Robertson, S., Walker, P. (2008). Un enfoque no letal de base química para investigar la calidad de los sedimentos portuarios. Ciencia del Medio Ambiente Total 389, 178-187.
Mitzel, M.R., Lin, N., Whalen, J.K., Tufenkji, N. (2017). Chlamydomonas reinhardtii muestra respuesta de natación aversiva a nanopartículas de plata Ciencia Ambiental: Nano 4, 1328-1338.
Ralph, P.J., Smith, R.A., Macinnis-Ng, C.M.O., Seery, C.R. (2007). Uso de bioensayos ecotoxicológicos basados en fluorescencia en el monitoreo de tóxicos y contaminación en sistemas acuáticos: Revisión. Química Toxicológica y Ambiental 89, 589-607.
Rastetter, N., Gerhardt, A. (2018). Monitoreo continuo del comportamiento de evitación con la lombriz Eisenia fetida. Diario de Suelos y Sedimentos 18, 957-967.
Skollema, S.B., Van Beusekom, S.A.M., Van der Geest, H.G., Booij, P., De Zwart, D., Vethaak, A.D., Admiraal, W. (2014). Bioensayos de laboratorio de algas usando fluorometría PAM: Efectos de las condiciones de prueba en la determinación de herbicidas y toxicidad de muestras de campo. Toxicología y Química Ambiental 33, 1017-1022.
Van der Geest, H.G., Greve, G.D., De Haas, E.M., Scheper, B.B., Kraak, M.H.S., Stuijfzand, S.C., Augustijn, C.H., Admiraal, W. (1999). Supervivencia y respuestas conductuales de larvas de la caddisfly Hydropsyche angustipennis al cobre y diazinón. Toxicología y Química Ambiental 18, 1965-1971.
¿Cuál es la importancia de incorporar criterios de valoración subletales en las pruebas de toxicidad aguda y crónica?
Nombrar un punto final subletal específico de un animal y una planta que se pueda incorporar en la prueba de toxicidad aguda.
Nombrar los dos criterios de valoración más comúnmente evaluados en las pruebas de toxicidad crónica.
4.3.4. Selección de organismos de prueba - Eco animales
Autor: Michiel Kraak
Revisores: Kees van Gestel, Jörg Römbke
Objetivos de aprendizaje:
Deberías ser capaz de
- nombrar los requisitos para los organismos de prueba de ecotoxicidad de laboratorio adecuados.
- enumerar los organismos de prueba estándar más utilizados por compartimento ambiental.
- argumentan la necesidad de más de una especie de prueba y la necesidad de organismos de prueba no estándar.
Palabras clave: Organismo de prueba, pruebas estandarizadas de ecotoxicidad de laboratorio, compartimento ambiental, hábitat, diferentes niveles tróficos
Introducción
Las pruebas estandarizadas de ecotoxicidad de laboratorio requieren condiciones de prueba constantes, criterios de valoración estandarizados (ver sección Puntos finales) y buen desempeño en los tratamientos de control. En realidad, en pruebas de toxicidad confiables, reproducibles y fáciles de realizar, el compuesto de prueba debe ser la única variable. Esto establece altas exigencias en la elección de los organismos de prueba.
Para una adecuada evaluación de riesgos, es crucial que las especies de prueba sean representativas de la comunidad o ecosistema a proteger. Los criterios para la selección de organismos a utilizar en las pruebas de toxicidad han sido resumidos por Van Gestel et al. (1997). Incluyen: 1. Argumentos prácticos, incluyendo factibilidad, costo-efectividad y rapidez de la prueba, 2. Aceptabilidad y estandarización de las pruebas, incluyendo la generación de resultados reproducibles, y 3. Importancia ecológica, incluyendo sensibilidad, validez biológica etc. El requisito más práctico es que el organismo de prueba sea fácil de cultivar y mantener, pero igualmente importante es que las especies de prueba sean sensibles a diferentes factores estresantes. Estos dos requisitos principales son, sin embargo, frecuentemente contradictorios. Las especies que son fáciles de cultivar suelen ser menos sensibles, simplemente porque en su mayoría son generalistas, mientras que las especies sensibles suelen ser especialistas, lo que dificulta mucho su cultivo. Para el apoyo científico y social de la elección de los organismos de prueba, preferiblemente deben ser tanto ecológica como económicamente relevantes o servir como especies emblemáticas, pero nuevamente, estos son requisitos opuestos. Las especies económicamente relevantes, como los cultivos y el ganado, apenas juegan un papel en los ecosistemas naturales, mientras que las especies ecológicamente altamente relevantes no tienen un valor económico obvio. Esto se refleja en los esfuerzos de investigación sobre estas especies, ya que se sabe mucho más sobre especies económicamente relevantes que sobre especies ecológicamente relevantes.
No hay especies que sean más sensibles a todos los contaminantes. Qué especie es más sensible depende del modo de acción y posiblemente también de otras propiedades del químico, la vía de exposición, su disponibilidad y las propiedades del organismo (p. ej., presencia de dianas específicas, fisiología, etc.). Por lo tanto, es importante probar siempre una serie de especies, con diferentes rasgos de vida, funciones y posiciones en la red alimentaria. Según Van Gestel et al. (1997) tal batería de especies de prueba debería ser:
1. Representativos del ecosistema a proteger, incluyendo organismos que tienen diferentes historias de vida, que representan diferentes grupos funcionales, diferentes grupos taxonómicos y diferentes vías de exposición;
2. Representante de respuestas pertinentes para la protección de poblaciones y comunidades; y
3. Uniforme, por lo que todas las pruebas en una batería deben ser aplicables al mismo medio de prueba y aplicarse a las mismas condiciones de prueba, por ejemplo, el mismo rango de valores de pH.
Representación de compartimientos ambientales
Cada compartimento ambiental, agua, aire, suelo y sedimento, requiere su conjunto específico de organismos de prueba. Los organismos de prueba más comúnmente aplicados son los dafínidos (Daphnia magna) para el agua, los quironómidos (Chironomus riparius) para los sedimentos y las lombrices de tierra (Eisenia fetida) para el suelo. Para el aire, en el campo de la toxicología por inhalación, los humanos y los roedores son en realidad el organismo más estudiado. En ecotoxicología, las pruebas de aire se restringen principalmente a las plantas, en lo que respecta a estudios sobre gases tóxicos. Además de los organismos más comúnmente aplicados, existe una larga lista de otros organismos de prueba estándar para los que se dispone de protocolos de prueba (Cuadro 1; sitio de la OCDE).
Cuadro 1. Lista no exhaustiva de especies estándar de prueba de ecotoxicidad.
|
Compartimiento (es) ambiental (es) |
Grupo de organismos |
Especies de prueba |
|
Agua |
Planta |
Myriophyllum spicatum |
|
Agua |
Planta |
Lemna |
|
Agua |
Algas |
Especies de elección |
|
Agua |
Cianobacterias |
Especies de elección |
|
Agua |
Pescados |
Danio rerio |
|
Agua |
Pescados |
Oryzias latipes |
|
Agua |
Anfibio |
Xenopus laevis |
|
Agua |
Insecto |
Chironomus riparius |
|
Agua |
Crustáceos |
Daphnia magna |
|
Agua |
Caracol |
Lymnaea stagnalis |
|
Agua |
Caracol |
Antípodaro potamopyrgus |
|
Sedimento de agua |
Planta |
Myriophyllum spicatum |
|
Sedimento de agua |
Insecto |
Chironomus riparius |
|
Sedimento de agua |
Gusano oligoquetos |
Lumbriculus variegatus |
|
Sedimento |
Bacterias anaerobias |
Lodos de aguas residuales |
|
Suelo |
Planta |
Especies de elección |
|
Suelo |
Gusano oligoquetos |
Eisenia fetida o E. andrei |
|
Suelo |
Gusano oligoquetos |
Enchytraeus albidus o E. crypticus |
|
Suelo |
Collembolano |
Folsomia candida o F. fimetaria |
|
Suelo |
Ácaro |
Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer |
|
Suelo |
Microorganismos |
Comunidad microbiana natural |
|
estiércol |
Insecto |
Scathophaga stercoraria |
|
estiércol |
Insecto |
Musca autumnalis |
|
aire-suelo |
Planta |
Especies de elección |
|
Terrestre |
Pájaro |
Especies de elección |
|
Terrestre |
Insecto |
Apis mellifera |
|
Terrestre |
Insecto |
Bombus terrestris/B. impatiens |
|
Terrestre |
Insecto |
Aphidius rhopalosiphi |
|
Terrestre |
Ácaro |
Typhlodromus pyri |
Organismos de prueba no estándar
El uso de organismos de prueba estándar en pruebas de ecotoxicidad estándar realizadas de acuerdo con protocolos aceptados internacionalmente reduce fuertemente las incertidumbres en las pruebas de ecotoxicidad. Sin embargo, existen buenas razones para desviarse de estos protocolos. Las especies en el Cuadro 1 se enumeran de acuerdo con su compartimento ambiental correspondiente, pero ignora las diferencias entre ecosistemas y hábitats. Los suelos pueden diferir ampliamente en su composición, dependiendo, por ejemplo, del contenido de arena, arcilla o limo, y propiedades, por ejemplo, pH y contenido de agua, cada uno albergando diferentes especies. De igual manera, el agua estancada y corriente tienen pocas especies en común. Esto implica que con base en argumentos ecológicos puede haber buenas razones para seleccionar organismos de prueba no estándar. Los efectos de los compuestos en arroyos se pueden estimar mejor con insectos ribereños que con el agua estancada que habita en los dafnidos, mientras que el gusano del compost Eisenia fetida no es necesariamente la especie más apropiada para suelos arenosos. La lista de organismos de prueba no estándar es, por supuesto, interminable, pero si los métodos están bien documentados en la literatura abierta, no hay limitaciones para emplear estas especies alternativas. Sin embargo, implican desafíos experimentales, ya que los organismos de prueba no estándar pueden ser difíciles de cultivar y mantener en condiciones de laboratorio y no hay protocolos disponibles para la prueba de ecotoxicidad. De esta manera, aumentar la relevancia ecológica de las pruebas de ecotoxicidad también aumenta las limitaciones logísticas y experimentales (ver capítulo 6 sobre Evaluación de riesgos).
Incrementar el número de especies de prueba
La gran mayoría de las pruebas de toxicidad se realizan con una sola especie de prueba, lo que resulta en grandes márgenes de incertidumbre sobre la peligrosidad de los compuestos. Para reducir estas incertidumbres y aumentar la relevancia ecológica se aconseja incorporar más especies de prueba pertenecientes a diferentes niveles tróficos, para el agua por ejemplo algas, dafnidos y peces. Para derivar estándares de calidad ambiental a partir de Distribuciones de Sensibilidad de Especie (ver sección sobre SSDs) se requieren datos de toxicidad para un mínimo de ocho especies pertenecientes a diferentes grupos taxonómicos. Esto obviamente provoca tensión entre los requisitos científicos y los recursos financieros disponibles.
Referencias
Sitio de la OCDE. https://www.oecd-ilibrary.org/enviro...stems_20745761.
Van Gestel, C.A.M., Léon, C.D., Van Straalen, N.M. (1997). Evaluación de pruebas de ecotoxicidad de fauna del suelo respecto a su uso en la evaluación de riesgos. En: Tarradellas, J., Bitton, G., Rossel, D. (Eds). Ecotoxicología de Suelos. CRC Press, Inc., Boca Ratón: 291-317.
Nombrar los requisitos para los organismos de prueba de ecotoxicidad de laboratorio adecuados.
Enumere los organismos de prueba estándar más utilizados por compartimento ambiental.
Argumentan 1] la necesidad de más de una especie de prueba, y 2] la necesidad de organismos de prueba no estándar.
4.3.5. Selección de organismos de prueba - Eco plantas
Autor: J. Arie Vonk
Revisores: Michiel Kraak, Gertie Arts, Sergi Sabater
Objetivos de aprendizaje:
Deberías ser capaz de
- nombrar los requisitos para pruebas de ecotoxicidad de laboratorio adecuadas para productores primarios
- enumerar los productores primarios y los criterios de valoración más utilizados en las pruebas estandarizadas de ecotoxicidad
- argumentan la necesidad de seleccionar productores primarios de diferentes compartimentos ambientales como organismos de prueba para pruebas de ecotoxicidad
Palabras clave: Organismo de prueba, prueba estandarizada de ecotoxicidad de laboratorio, productores primarios, algas, plantas, compartimento ambiental, fotosíntesis, crecimiento
Introducción
Los productores primarios foto-autotróficos utilizan clorofila para convertir CO 2 y H 2 O en materia orgánica a través de la fotosíntesis bajo la luz (solar). Estos productores primarios son la base de la red alimentaria y forman un componente esencial de los ecosistemas. Además de servir como fuente de alimento, los fotoautótrofos multicelulares también forman hábitat para otros productores primarios (epífitas) y muchas especies de fauna. Los productores primarios son un grupo muy diverso, que van desde pequeños pico-plancton unicelulares hasta árboles gigantescos. Para las pruebas estandarizadas de ecotoxicidad, los productores primarios están representados por (micro) algas, macrófitos acuáticos y plantas terrestres. Dado que los herbicidas son el grupo más grande de pesticidas utilizados a nivel mundial para mantener una alta producción de cultivos en la agricultura, es importante evaluar su impacto en los productores primarios (Wang & Freemark, 1995). Sin embargo, en lo que respecta a la intensidad de las pruebas, los productores primarios están subestudiados en comparación
Las pruebas estandarizadas de ecotoxicidad de laboratorio con productores primarios requieren un buen control sobre las condiciones de prueba, criterios de valoración estandarizados (Arts et al., 2008; ver la Sección de Puntos de valoración) y crecimiento en los controles (es decir, duplicación de recuentos celulares, longitud y/o biomasa dentro del periodo experimental). Dado que el metabolismo de los productores primarios está fuertemente influenciado por las condiciones de luz, disponibilidad de agua y carbono inorgánico (CO 2 y/o HCO 3 - y CO 3 2-), temperatura y concentraciones de nutrientes disueltos, todas estas condiciones deben ser vigilado de cerca. Los criterios generales para la selección de organismos de prueba se describen en el capítulo anterior (ver el apartado sobre Selección de organismos de prueba de ecotoxicidad). Para los productores primarios, la elección se basa principalmente en las pautas de prueba disponibles, las especies de prueba y el compartimento ambiental de preocupación.
Pruebas estandarizadas de ecotoxicidad con productores primarios
Hay una serie de pruebas de ecotoxicidad con una variedad de productores primarios estandarizados por diferentes organizaciones incluyendo la OCDE y la USEPA (Cuadro 1). La característica de la mayoría de los productores primarios es que están creciendo en más de un compartimento ambiental (suelo/sedimento; agua; aire). Como resultado de esto, la captación de tóxicos para estos fotoautótrofos puede ser diversa, dependiendo de la sustancia química y del compartimento donde se produzca la exposición (aire, agua, sedimento/suelo).
Tanto para ecosistemas marinos como de agua dulce, se dispone de pruebas estandarizadas de ecotoxicidad para microalgas (microorganismos unicelulares que a veces forman colonias más grandes), incluyendo las cianobacterias procariotas (algas verdeazuladas) y las Chlorophyta eucariotas (algas verdes) y Bacillariophyceae (diatomeas). Los macrófitos (macroalgas y plantas acuáticas) son organismos multicelulares, estos últimos compuestos por tejidos diferenciados, con una serie de especies incluidas en pruebas estandarizadas de ecotoxicidad. Mientras que las macroalgas crecen solo en el compartimento de agua, las plantas acuáticas se dividen en grupos relacionados con su forma de crecimiento (emergentes; flotación libre; sumergidas y enraizadas en sedimentos; flotantes y enraizadas en sedimentos) y pueden extenderse desde el sedimento (raíces y portainjertos) a través del agua hacia el aire. Tanto las macroalgas como las plantas acuáticas contienen una amplia gama de taxones y están presentes tanto en ecosistemas marinos como de agua dulce.
Las plantas terrestres superiores son muy diversas, desde pastos pequeños hasta árboles grandes. Las plantas incluidas en pruebas estandarizadas de ecotoxicidad consisten en especies de cultivos y no cultivos. Una distinción importante en las plantas terrestres se refleja en dicotiledóneas y monocotiledóneas, ya que ambos grupos difieren en sus vías metabólicas y podrían reflejar una diferencia en la sensibilidad a los contaminantes.
Cuadro 1. Lineamientos estándar de código abierto para probar el efecto de compuestos en productores primarios. Todas las pruebas se realizan en (micro) cosmos excepto marcados con *
|
Productor primario |
Especies |
Compartimento |
Número de prueba |
Organización |
|
Microalgas y ciano-bacterias |
diversas especies |
Agua Dulce |
201 |
|
Anabaena flos-aque |
Agua Dulce |
850.4550 |
||
|
Pseudokirchneriella subcapitata, Esqueletonema costatum |
Agua dulce, Agua marina |
850.4500 |
||
|
Macrófitas flotantes |
Lemna spp. |
Agua Dulce |
221 |
|
|
Lemna spp. |
Agua Dulce |
850.4400 |
||
|
Macrófitas sumergidas |
Myriophyllum spicatum |
Agua Dulce |
238 |
|
Myriophyllum spicatum |
Sedimento (Agua Dulce) |
239 |
||
|
Plantas acuáticas* |
no especificado |
Agua Dulce |
850.4450 |
|
|
Plantas terrestres |
amplia variedad de especies |
Aire |
227 |
|
|
amplia variedad de especies |
Aire |
850.4150 |
||
|
amplia variedad de especies (cultivos y no cultivos) |
Suelo y aire |
850.4230 |
||
|
leguminosas y simbionte rizobio |
Suelo y aire |
850.4600 |
||
|
amplia variedad de especies (cultivos y no cultivos) |
Suelo |
208 |
||
|
amplia variedad de especies (cultivos y no cultivos) |
Suelo |
850.4100 |
||
|
diversas especies de cultivos |
Suelo y aire |
850.4800 |
||
|
Plantas terrestres* |
no especificado |
Terrestre |
850.4300 |
Representación de compartimientos ambientales
Dado que los productores primarios pueden absorber muchos compuestos directamente por las células y los talos (algas) o por sus hojas, tallos, raíces y rizomas (plantas), es necesario incluir diferentes compartimentos ambientales en las pruebas de ecotoxicidad dependiendo de las características químicas de los contaminantes. Además, las características químicas del compuesto en consideración determinan si y cómo el compuesto podría ingresar a los productores primarios y cómo se transporta a través de organismos.
Para todos los productores primarios acuáticos, la exposición a través de la fase acuosa es relevante. La exposición al aire ocurre en las plantas acuáticas emergentes y flotantes, mientras que las plantas de enraizamiento y las algas con rizoides podrían estar expuestas a través de sedimentos. La exposición a los sedimentos introduce desafíos adicionales para las condiciones de prueba estandarizadas, ya que los cambios en las condiciones redox y el contenido de materia orgánica de los sedimentos pueden alterar el comportamiento de los compuestos en este compartimento.
Todas las plantas terrestres están expuestas a través del aire, el suelo y el agua (humedad del suelo, lluvia, riego). La exposición al aire y la deposición de agua (lluvia o pulverización) exponen directamente las partes aéreas de las plantas terrestres, mientras que las partes y semillas de las plantas subterráneas se exponen a través del suelo y la humedad del suelo. La exposición al suelo introduce desafíos adicionales para las condiciones de prueba estandarizadas, ya que los cambios en el contenido de materia orgánica de agua o sedimento de los suelos pueden alterar el comportamiento de los compuestos en este compartimento.
Puntos finales de prueba
La bioacumulación después de la captación y translocación a orgánulos celulares específicos o tejido vegetal puede resultar en la incorporación de compuestos en productores primarios. Esto se ha observado para metales pesados, pesticidas y otros químicos orgánicos. Los compuestos acumulados en productores primarios pueden entonces ingresar a la cadena alimentaria y ser transferidos a niveles tróficos más altos (ver la sección de Biomagnificación). Aunque las concentraciones en productores primarios son indicativas de la presencia de compuestos biodisponibles, estas concentraciones no necesariamente implican efectos adversos sobre estos organismos. Por lo tanto, las mediciones de bioacumulación se pueden combinar mejor con una o más de las siguientes evaluaciones de criterio de valoración.
La fotosíntesis es la vía metabólica más esencial para los productores primarios. El modo de acción de muchos herbicidas es, por lo tanto, la inhibición de la fotosíntesis, mediante la cual se pueden apuntar diferentes etapas metabólicas (ver la sección sobre Toxicidad herbicida). Este criterio de valoración es relevante para evaluar los efectos agudos sobre el transporte de electrones de clorofila mediante fluorometría Pulso-Amplitud-Modulation (PAM) o como medida de la producción de oxígeno o carbono por productores primarios.
El crecimiento representa la acumulación de biomasa (microalgas) o masa (productores primarios multicelulares). La inhibición del crecimiento es el punto final más importante en la prueba con productores primarios ya que este criterio integra respuestas de una amplia gama de efectos metabólicos en un organismo completo o una respuesta poblacional de productores primarios. Sin embargo, se tarda más en evaluar, especialmente para los productores primarios más grandes. Los recuentos celulares, el aumento de tamaño a lo largo del tiempo para hojas, raíces u organismos enteros, y (bio) masa (peso fresco y peso seco) son los criterios de valoración de crecimiento más utilizados.
La emergencia de las plántulas refleja la germinación y el desarrollo temprano de las plántulas en plantas. Este punto final es especialmente relevante para plantas perennes y semestrales dependiendo de la dispersión de semillas y la germinación exitosa para mantener poblaciones sanas.
Otros criterios de valoración incluyen el alargamiento de diferentes partes de la planta (por ejemplo, raíces), necrosis de las hojas o alteraciones en las relaciones simbiontes planta-microbiana.
Limitaciones actuales y desafíos para el uso de productores primarios en pruebas de ecotoxicidad
Para las plantas vasculares terrestres, muchas especies de cultivos y no cultivos pueden ser utilizadas en pruebas estandarizadas, sin embargo, para otros compartimentos ambientales (acuáticos y marinos) pocas especies están disponibles en las guías de prueba estandarizadas. Además, actualmente no todos los compartimentos ambientales están cubiertos por pruebas estandarizadas para productores primarios. En general, hay pruebas limitadas para sedimentos acuáticos y hay una falta total de pruebas para sedimentos marinos. Finalmente, no todos los grupos principales de productores primarios están representados en pruebas estandarizadas de toxicidad, por ejemplo, musgos y algunos grupos principales de algas están ausentes.
Los desafíos para mejorar las pruebas de ecotoxicidad con plantas serían incluir criterios de valoración más sensibles y de respuesta temprana. Para la exposición del suelo y los sedimentos de las plantas a contaminantes, el desarrollo de criterios de valoración relacionados con la morfología de las raíces y el metabolismo radicular podría proporcionar información sobre el impacto temprano de las sustancias en las partes expuestas de También el desarrollo de criterios ecotoxicogenómicos (p. ej. metabolómica) (ver la sección Metabolómica) en el campo de las pruebas de toxicidad vegetal nos permitiría determinar los efectos en una gama más amplia de vías metabólicas de las plantas.
Referencias
Arts, G.H.P., Belgers, J.D.M., Hoekzema, C.H., Thissen, J.T.N.M. (2008). Sensibilidad de macrófitas sumergidas de agua dulce y criterios de valoración en pruebas de toxicidad de laboratorio. Contaminación Ambiental 153, 199-206.
Wang, W.C., Freemark, K. (1995) El uso de plantas para monitoreo y evaluación ambiental. Ecotoxicología y Seguridad Ambiental 30:289-301.
¿Qué condiciones deben controlarse cuidadosamente en las pruebas de ecotoxicidad de laboratorio con productores primarios?
Enumerar los diferentes grupos de productores primarios utilizados en las pruebas estandarizadas para cada compartimento ambiental.
Argumentar por qué las pruebas de productores primarios son relevantes en relación con [A] la exposición ambiental de los ecosistemas a pesticidas y [B] el papel de los productores primarios en los ecosistemas
4.3.6. Selección de organismos de prueba - Microorganismos
Autor: Patrick van Beelen
Revisores: Kees van Gestel, Erland Bååth, Maria Niklinska
Objetivos de aprendizaje:
Deberías ser capaz de
- describir el papel vital de los microorganismos en los ecosistemas.
- explicar la diferencia entre las pruebas de toxicidad para proteger la biodiversidad y para proteger los servicios ecosistémicos.
- explicar por qué las pruebas microbianas a corto plazo pueden ser más sensibles que las de largo plazo
Palabras clave: microorganismos, procesos, conversión de nitrógeno, métodos de ensayo
La importancia de los microorganismos
La mayoría de los organismos son microorganismos, lo que significa que generalmente son demasiado pequeños para verlos a simple vista. Sin embargo, los microorganismos afectan casi todos los aspectos de nuestras vidas. Los virus son los microorganismos más pequeños, las bacterias procariotas y las arqueas son más grandes (en el rango micrométrico), y los tamaños de los microorganismos eucariotas oscilan entre los trescientos micrómetros. Los eucariotas microscópicos tienen células más grandes con un núcleo y vienen en diferentes formas como algas verdes, protistas y hongos.
Las cianobacterias y las algas eucariotas realizan fotosíntesis en los océanos, mares, ecosistemas salobre y de agua dulce. Fijan el dióxido de carbono en biomasa y forman la base de los ecosistemas acuáticos más grandes. Las bacterias y los hongos degradan moléculas orgánicas complejas en dióxido de carbono y minerales, que son necesarios para el crecimiento de las plantas.
Las plantas suelen vivir en simbiosis con microorganismos especializados en sus raíces, lo que facilita su crecimiento al potenciar la absorción de agua y nutrientes, acelerando el crecimiento de las plantas. Los animales invertebrados y vertebrados, incluidos los humanos, tienen bacterias y otros microorganismos en sus intestinos para facilitar la digestión de los alimentos. Las vacas, por ejemplo, no pueden digerir el pasto sin los microorganismos en su rumen. Además, las termitas no serían capaces de digerir la lignina, un polímero de madera difícil de digerir, sin la ayuda de hongos intestinales. Las hormigas cortadoras transportan las hojas a su nido para alimentar a los hongos de los que dependen. Además, los humanos consumen muchos alimentos con levaduras, hongos o bacterias para la conservación de los alimentos y un sabor agradable. La cerveza, el vino, el queso, el yogur, el chucrut, el vinagre, el pan, el tempeh, el embutido y otros alimentos pueden necesitar el tipo adecuado de microorganismos para ser apetecibles. Tener el tipo adecuado de microorganismos también es vital para la salud humana. La leche materna humana contiene oligosacáridos, que son indigeribles para el recién nacido. Estos sirven como una importante fuente de alimento para las bacterias intestinales en el bebé, que reducen el riesgo de infecciones peligrosas.
Esto demuestra que la interacción entre microorganismos específicos y organismos superiores suele ser altamente específica. Los virus marinos son muy abundantes y pueden limitar las floraciones algales promoviendo un fitoplancton marino más diverso. Virus patógenos, bacterias, hongos y protistas potencian la biodiversidad de plantas y animales mediante el siguiente mecanismo: Las poblaciones más densas son más susceptibles a enfermedades ya que la transmisión de la enfermedad se vuelve más frecuente. Cuando las especies más abundantes se vuelven menos frecuentes, hay más espacio para las otras especies y se mejora la biodiversidad. En la agricultura, esta biodiversidad mejorada no es deseada ya que la ganadería y el cultivo son las especies más abundantes. Es por ello que el control de enfermedades se vuelve más importante en la ganadería de alta intensidad y en los grandes monocultivos de cultivos. Los microorganismos están en la base de todos los ecosistemas y son vitales para la salud humana y el medio ambiente.
La sociedad microbiológica tiene un bonito video explicando por qué es importante la microbiología.
Metas de protección
El funcionamiento de los ecosistemas naturales en la tierra se ve amenazado por muchos factores, como la pérdida de hábitat, la fragmentación del hábitat, el calentamiento global, la extinción de especies, la sobrefertilización, la acidificación y la contaminación. Los químicos naturales y artificiales pueden exhibir efectos tóxicos en los diferentes organismos en los ecosistemas naturales. Los químicos tóxicos liberados en el medio ambiente pueden tener efectos negativos sobre la biodiversidad o los procesos microbianos. En el ecosistema fuertemente afectado por tales cambios, la abundancia de diferentes especies podría ser menor. La pérdida de biodiversidad de la especie en un ecosistema específico puede ser utilizada como una medida para la degradación del ecosistema. Los humanos se benefician de la presencia de ecosistemas que funcionan correctamente. Estos beneficios pueden cuantificarse como servicios ecosistémicos. Los procesos microbianos contribuyen fuertemente a muchos servicios ecosistémicos. El agua subterránea, por ejemplo, suele ser una fuente adecuada de agua potable ya que los microorganismos han eliminado contaminantes y patógenos del agua infiltrante. Consulte la Sección Servicios ecosistémicos y metas de protección.
Ensayos de toxicidad ambiental
La mayoría de las pruebas de toxicidad ambiental son pruebas de especies individuales. Tales pruebas suelen determinar la toxicidad de un producto químico para una especie biológica específica como por ejemplo la bioluminiscencia por la bacteria Allivibrio fisheri en la prueba Microtox o la prueba de inhibición del crecimiento en algas de agua dulce y cianobacterias (ver Sección sobre Selección de prueba organismos - Plantas ecológicas). Estas pruebas son relativamente simples utilizando un químico tóxico específico en una especie biológica específica en un entorno óptimo. Los lineamientos de la OCDE para las pruebas de productos químicos, sección 2, efectos sobre los sistemas bióticos da una lista de pruebas estándar. En el Cuadro 1 se enumeran diferentes pruebas con microorganismos estandarizados por la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE).
Cuadro 1. Pruebas de toxicidad ambiental generalmente aceptadas con microorganismos, estandarizadas por la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE).
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Prueba OCDE No |
Titulo |
Mediano |
Tipo de prueba |
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Algas de agua dulce y cianobacterias, prueba de inhibición del crecimiento (referencia del capítulo) |
Acuáticos |
Especie individual |
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Lodos activados, prueba de inhibición de la respiración |
Sedimento |
Proceso |
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224 (proyecto de directriz) |
Determinación de la inhibición de la actividad de bacterias anaerobias |
Sedimento |
Proceso |
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Microorganismos del suelo: prueba de transformación de carbono |
Suelo |
Proceso |
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Microorganismos del suelo: prueba de transformación de nitrógeno |
Suelo |
Proceso |
El resultado de estas pruebas se puede resumir como valores EC 10 (ver Sección Relaciones concentración-respuesta), que pueden ser utilizados en la evaluación de riesgos (ver Secciones sobre Enfoques y herramientas de evaluación predictiva del riesgo y sobre Enfoques de evaluación de riesgos diagnósticos y herramientas) Básicamente, existen tres tipos de pruebas. Pruebas de especies individuales, pruebas comunitarias y pruebas mediante procesos microbianos.
Pruebas de especies individuales
La relevancia ecológica de una prueba de una sola especie puede ser tema de debate. En la mayoría de los casos no es práctico trabajar con especies ecológicamente relevantes ya que éstas pueden ser difíciles de mantener en condiciones de laboratorio. Cada ecosistema también tendrá sus propias especies ecológicamente relevantes, lo que requeriría una batería extremadamente grande de diferentes especies de prueba y pruebas, que son difíciles de realizar de manera reproducible. Como solución a estos problemas, se supone que las especies de prueba exhiben una sensibilidad similar a los tóxicos que las especies relevantes para el medio ambiente. Este supuesto fue confirmado en una serie de casos. Si la distribución de sensibilidad de un tóxico dado para varias especies de prueba fuera similar a la distribución de sensibilidad de las especies relevantes en un ecosistema específico, se podría usar un método estadístico para estimar una concentración segura para la mayoría de las especies.
Las pruebas de toxicidad con tiempos de incubación cortos a menudo se disputan ya que los tóxicos tardan en acumularse en los animales de prueba. Esto no es un problema en las pruebas de toxicidad microbiana ya que el pequeño tamaño de los organismos de prueba permite un rápido equilibrio de las concentraciones del tóxico en el agua y en el organismo de prueba. Por el contrario, los largos tiempos de incubación en condiciones que promueven el crecimiento, pueden llevar a la aparición de mutantes resistentes, lo que disminuirá la aparente sensibilidad del organismo de prueba. Sin embargo, esta selección y crecimiento de mutantes resistentes no puede considerarse como algo positivo ya que estos mutantes son diferentes de la cepa parental y también pueden tener diferentes propiedades ecológicas. De hecho, la selección de microorganismos resistentes a antibióticos en el ambiente se considera un problema ya que estos podrían transferirse a microorganismos patógenos (promotores de enfermedades) lo que da problemas a los pacientes tratados con antibióticos.
La prueba de la OCDE no 201, que utiliza algas de agua dulce y cianobacterias, es una prueba de ecotoxicidad microbiana de especies individuales bien conocida y sensible. Estos se explican con más detalle en la Sección de Selección de organismos de prueba - Plantas ecológicas.
Pruebas comunitarias
Los microorganismos tienen un rango muy amplio de diversidad metabólica. Esto hace que sea más difícil extrapolar de una prueba de una sola especie a todas las especies microbianas posibles incluyendo hongos, protistas, bacterias, arqueas y virus. Una solución es probar una multitud de especies (toda una comunidad) expuestas en un solo experimento de toxicidad, se vuelve más difícil atribuir la disminución o aumento de especies a efectos tóxicos. El aumento y disminución de las especies también puede ser causado por otros factores, incluyendo las interacciones entre especies. El método de tolerancia comunitaria inducida por contaminación se utiliza para la detección de efectos tóxicos en las comunidades. Los organismos sobreviven en ambientes contaminados solo cuando pueden tolerar concentraciones químicas tóxicas en su hábitat. Durante la exposición a la contaminación las especies sensibles se extinguen y las especies tolerantes toman su lugar y papel en el ecosistema (Figura 1). Esta toma de posesión puede ser monitoreada por pruebas de toxicidad muy simples utilizando una parte de la comunidad extraída del ambiente. Algunas pruebas utilizan la incorporación de bloques de construcción para ADN (timidina) y proteína (leucina). Otras pruebas utilizan diferentes sustratos para el crecimiento microbiano. La observación de que esta parte de la comunidad se vuelve más tolerante según lo medido por estas simples pruebas de toxicidad revela que el contaminante realmente afecta a la comunidad microbiana. Esto es especialmente útil cuando se estudian entornos complejos y diversos como biopelículas, sedimentos y suelos.
Pruebas mediante procesos microbianos
La protección de los servicios ecosistémicos es fundamentalmente diferente de la protección de la biodiversidad. Cuando se quiere proteger la biodiversidad, todas las especies son igualmente importantes y valen la pena protegerlas. Cuando se quiere proteger los servicios ecosistémicos solo las especies que realizan el proceso tienen que ser protegidas. Muchas especies contribuyentes pueden ser intoxicadas sin tener mucho impacto en el proceso. Un ejemplo es la transformación de nitrógeno, la cual se prueba midiendo la conversión de amonio en nitrito y nitrato (ver cuadro).
La inactivación de las especies más sensibles puede ser compensada por la prolongada actividad o crecimiento de especies menos sensibles. El diseño de pruebas de proceso microbiano tiene como objetivo proteger el proceso y no las especies contribuyentes. En consecuencia, las pruebas de proceso del Cuadro 1 rara vez juegan un papel decisivo en la reducción de la concentración máxima tolerable de un químico. La razón es que las pruebas de toxicidad de especies individuales generalmente son más sensibles ya que utilizan una especie biológica específica como organismo de prueba en lugar de un proceso.
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Caja: Prueba de transformación de nitrógeno La prueba de la OCDE no. 216 Microorganismos del Suelo: Prueba de Transformación de Nitrógeno es una prueba de toxicidad muy conocida que utiliza el proceso de transformación de nitrógeno La prueba para no agroquímicos está diseñada para detectar efectos adversos persistentes de un tóxico en el proceso de transformación de nitrógeno en suelos. La harina de trébol en polvo contiene nitrógeno principalmente en forma de proteínas que pueden degradarse y oxidarse para producir nitrato. El suelo se modifica con harina de trébol y se trata con diferentes concentraciones de un tóxico. El suelo proporciona tanto los organismos de prueba como el medio de prueba. Se utiliza un suelo arenoso con bajo contenido de carbono orgánico para minimizar la sorción del tóxico al suelo. La sorción puede disminuir la toxicidad de un tóxico en el suelo. Según la directriz, los microorganismos del suelo no deben estar expuestos a fertilizantes, productos de protección de cultivos, materiales biológicos o contaminaciones accidentales durante al menos tres meses antes de que se muestree el suelo. Además, los microorganismos del suelo deben formar al menos 1% del carbono orgánico del suelo. Esto indica que los microorganismos siguen vivos. El suelo se incuba con harina de trébol y el tóxico en condiciones favorables de crecimiento (temperatura óptima, humedad) para los microorganismos. Las cantidades de nitrato formadas se miden después de 7 y 28 días de incubación. Esto permite el crecimiento de microorganismos resistentes al tóxico durante la prueba, lo que puede hacer que el tiempo de incubación más largo sea menos sensible. El nitrógeno en las proteínas de la harina de trébol se convertirá en amoníaco por procesos generales de degradación. La conversión de harina de trébol en amoníaco puede ser realizada por multitud de especies y por lo tanto no es muy sensible a la inhibición por compuestos tóxicos.
La conversión de amoníaco a nitrato generalmente se realiza en dos etapas. Primero, bacterias oxidantes de amoníaco o arqueas, oxidan el amoníaco en nitrito. Segundo, el nitrito es oxidado por nitrito oxidando bacterias en nitrato. Estos dos últimos pasos son generalmente mucho más lentos que la producción de amonio, ya que requieren microorganismos especializados. Estos microorganismos especializados también tienen una tasa de crecimiento menor que los microorganismos comunes involucrados en la degradación general de las proteínas en aminoácidos. Esto hace que la prueba de transformación de nitrógeno sea mucho más sensible en comparación con la prueba de transformación de carbono, que utiliza microorganismos más comunes. Bajo las condiciones óptimas en la prueba de transformación de nitrógeno, algunas especies menores oxidantes de amoníaco o nitrito pueden parecer poco importantes ya que no contribuyen mucho al proceso general. Sin embargo, estas especies menores pueden llegar a ser de mayor importancia en condiciones menos óptimas. Bajo condiciones ácidas, por ejemplo, solo las arqueas oxidan el amoníaco en nitrito mientras que las bacterias oxidantes del amoníaco se inhiben. La prueba de transformación de nitrógeno tiene una duración mínima de 28 días a 20°C en condiciones óptimas de humedad, pero puede prolongarse a 100 días. Los tiempos de incubación más cortos harían que la prueba fuera más sensible. |
¿Cuál es la desventaja del crecimiento durante una prueba de toxicidad usando un proceso microbiano?
Mencionar los intermedios durante la degradación de la harina de trébol a nitrato.
¿Por qué las pruebas microbianas más cortas suelen ser más sensibles que las más largas?
Cuando una especie microbiana en el ambiente es reemplazada por otra, ¿puede afectar a animales o plantas?
4.3.7. Selección de organismos de prueba - Aves
Autor: Annegaaike Leopold
Revisores: Nico van den Brink, Kees van Gestel, Peter Edwards
Objetivos de aprendizaje:
Deberías ser capaz de
- Comprender y argumentar por qué las aves son un modelo importante en ecotoxicología;
- comprender y argumentar el objetivo de las pruebas de toxicidad aviar realizadas con fines reglamentarios;
- enumerar las especies aviares más utilizadas;
- enumerar los criterios de valoración utilizados en las pruebas de toxicidad aviar;
- nombrar ejemplos de cómo se puede reducir la incertidumbre en la evaluación del riesgo de químicos para las aves.
Palabras clave: aves, evaluación de riesgo, hábitats, aguda, reproducción.
Introducción
Las aves son vistas como modelos importantes en ecotoxicología por varias razones:
- son un orden diverso, abundante y generalizado que habita muchos hábitats humanos alterados como la agricultura;
- tienen características fisiológicas que los hacen diferentes de otras clases de vertebrados que pueden afectar su sensibilidad a la exposición química;
- desempeñan un papel específico ecológicamente y cumplen funciones esenciales en los ecosistemas (por ejemplo, en la dispersión de semillas, como agentes de control biológico a través de la alimentación de insectos y la eliminación de cadáveres, por ejemplo, por buitres);
- los objetivos de protección se centran frecuentemente en especies icónicas que atraen al público.
Aquí se discutirán algunas características fisiológicas específicas. Las aves son ovíparas, poniendo huevos con cáscaras duras. Esto conduce a una exposición concentrada (a diferencia de la exposición a través del torrente sanguíneo como en la mayoría de las otras especies vertrebradas) al material transferido materno y, en su caso, a sus metabolitos. También significa que las crías reciben un solo suministro de nutrientes (y no un suministro continuo a través del torrente sanguíneo). Esto hace que las aves sean sensibles a los contaminantes de una manera diferente a la de los vertebrados no ovíparos, ya que los embriones se desarrollan sin interferencia materna fisiológica. El embrión de ave comienza a regular su propia homeostasis hormonal desde el principio de su desarrollo en contraste con los embriones de mamíferos. Como resultado, los contaminantes depositados en el huevo por el ave hembra pueden causar alteración de la regulación de estos procesos embrionarios (Murk et al., 1996). Las aves tienen una temperatura corporal más alta (40.6 ºC) y una tasa metabólica relativamente alta, lo que puede afectar su respuesta a los productos químicos. Como polluelos, las aves generalmente tienen una tasa de crecimiento rápida, en comparación con muchas especies de vertebrados. Los polluelos de especies precociales (o nidifugas) abandonan el nido al eclosionar y, si bien pueden seguir a los padres alrededor, están completamente emplumados y se alimentan de forma independiente. Por lo general, necesitan unos meses para crecer a tamaño completo. Las especies altriciales están desnudas, ciegas e indefensas al momento de la eclosión y requieren el cuidado de los padres hasta que abandonan el nido. A menudo crecen más rápido: los paseriformes (como las golondrinas) pueden alcanzar el tamaño completo y el fledge 14 días después de la eclosión. Muchas especies de aves migran estacionalmente a largas distancias y la adaptación a esto, cambia su fisiología y procesos bioquímicos. Las concentraciones internas de contaminantes orgánicos, por ejemplo, pueden aumentar significativamente debido al uso de reservas de lípidos durante la migración, mientras que los cambios en la bioquímica pueden aumentar la sensibilidad de las aves al químico.
Las aves funcionan como buenos indicadores biológicos de la calidad ambiental, en gran parte debido a su posición en la cadena alimentaria y la dependencia del hábitat. Los objetivos de protección se centran frecuentemente en especies icónicas, por ejemplo el frailecillo atlántico, la tórtola europea y la lechuza común (Birdlife International, 2018).
Se reconoció desde el principio que la exposición de las aves a los pesticidas puede tener lugar a través de muchas rutas de exposición dietética. Dada su asociación con una amplia gama de hábitats, la exposición puede tener lugar alimentándose del propio cultivo, de malezas, o semillas de malezas (tratadas), en invertebrados de viviendas en el suelo o foliares, alimentándose de invertebrados en el suelo, como lombrices de tierra, bebiendo agua de arroyos contaminados o alimentándose de peces que viven en arroyos contaminados (Figura 1, Brooks et al., 2017). Tras la introducción de pesticidas sintéticos persistentes y altamente tóxicos en la década de 1950 y antes de las regulaciones de seguridad, el uso de muchos pesticidas orgánicos sintéticos provocó pérdidas de vida silvestre, de aves, peces y otros animales silvestres (Kendall y Lacher, 1994). Como resultado, en la década de 1970 se desarrollaron lineamientos nacionales e internacionales para evaluar los primeros efectos agudos y subagudos de los plaguicidas en las aves. A principios de la década de 1980 se desarrollaron pruebas para estudiar los efectos a largo plazo o reproductivos de los pesticidas Las pautas actuales para las pruebas de aves se centraron principalmente en los ingredientes activos utilizados en productos fitosanitarios, medicamentos veterinarios y biocidas. En Europa la regulación de productos químicos industriales REACH solo requiere información sobre toxicidad a largo plazo o reproductiva para sustancias fabricadas o importadas en cantidades de al menos 1000 toneladas anuales. Estos datos pueden ser necesarios para evaluar los riesgos de intoxicación secundaria por una sustancia que es probable que se bioacumule y no se degrade rápidamente. El envenenamiento secundario puede ocurrir, por ejemplo, cuando las rapaces consumen peces contaminados. En Estados Unidos no se requieren pruebas con aves bajo la legislación de productos químicos industriales.
El objetivo de realizar pruebas de toxicidad aviar es informar una evaluación de los efectos aviares (Hart et al., 2001) con el fin de:
- proporcionar información científicamente sólida sobre el tipo, tamaño, frecuencia y patrón a lo largo del tiempo de los efectos esperados de exposiciones definidas de aves a productos químicos.
- reducir la incertidumbre sobre los efectos potenciales de los químicos en las aves.
- proporcionar información en una forma adecuada para su uso en la evaluación de riesgos.
- proporcionar esta información de manera que haga un uso eficiente de los recursos y evite el uso innecesario y el sufrimiento de los animales.
Especies de aves utilizadas en pruebas de toxicidad
La selección de especies de aves para pruebas de toxicidad se realiza principalmente en función de su relevancia ecológica, su disponibilidad y capacidad para ajustarse a las condiciones de laboratorio para la reproducción y las pruebas. Esto significa que la mayoría de las especies de prueba han sido domesticadas durante muchos años. Deberían haber demostrado ser relativamente sensibles a los productos químicos a través de experiencia previa o literatura publicada e idealmente tener datos históricos de control disponibles.
Las especies de aves más utilizadas en las pruebas de toxicidad han sido domesticadas:
- la especie de aves acuáticas pato real (Anas platyrynchos) se encuentra en el rango medio de sensibilidad a los productos químicos, un alimentador omnívoro, abundante en muchas partes del mundo, una especie precocial; las aves criadas comercialmente y de prueba muestran plumaje de tipo silvestre;
- la especie de caza de morada terrestre codornices (Colinus virginianus) es común en los Estados Unidos y es de similar sensibilidad a los ánades reales; se alimenta principalmente de semillas e invertebrados; una especie precoz; criadas comercialmente y aves de prueba muestran plumaje de tipo silvestre;
- la especie habitante del suelo La codorniz japonesa (Coturnix coturnix japonica) se encuentra naturalmente en el este de Asia; se alimenta de material vegetal e invertebrados terrestres. Domesticadas en gran medida que las codornices reales o bobwhite y las aves criadas comercialmente (para huevos o para carne) se eliminan genéticamente del tipo silvestre. Esta especie es única en que los jóvenes del año maduran y se reproducen (ellos mismos) dentro de los 12 meses;
- el paseriforme, especie altricial pinzón cebra (Taeniopygia guttata) se encuentra naturalmente en Australia e Indonesia; comen semillas; se mantienen y venden como mascotas; no están muy alejados del tipo silvestre;
- el periquito (Melopsittacus undulates) también es altricial); se presenta de forma natural en Australia; come semillas comiendo; se cría en cautiverio y se mantiene y se vende como mascotas.
Otras especies de aves se utilizan a veces para estudios específicos, a menudo diseñados a medida. Estas especies incluyen:
- el canario (Serinus canaria domestica).
- la paloma de roca (Columba livia)
- el gorrión común (Passer domesticus),
- Mirlo de alas rojas (Agelaius phoeniceus) - US only
- el faisán de cuello anillado, (Phasianus colchicus),
- la perdiz gris (Perdix perdix)
Pruebas de toxicidad aviar más comunes:
La Tabla 1 ofrece una visión general de todas las pruebas de toxicidad aviar que se han desarrollado en los últimos aproximadamente 40 años, las pautas más utilizadas, las especies recomendadas, los criterios de valoración registrados en cada una de estas pruebas, la edad típica de las aves al inicio de la prueba, la duración de la prueba y la longitud de exposición.
Cuadro 1: Pruebas de toxicidad aviar más comunes con sus especies recomendadas y características clave.
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Prueba de toxicidad aviar |
Directriz |
Especies recomendadas |
Puntos finales |
Edad al inicio de la prueba |
Duración del estudio |
Duración de la exposición |
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Gavage oral agudo - pruebas secuenciales - promedio 26 aves |
codorniz bobwhite, codorniz japonesa, pinzón cebra, periquito |
mortalidad, signos clínicos, peso corporal, consumo de alimentos, necropsia |
Aves jóvenes aún no apareadas, de al menos 16 semanas de edad al inicio de la prueba. |
Al menos 14 días |
Dosis oral única al inicio de la prueba |
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Gavage oral agudo - Diseño de 60 aves |
USEPA OCSPP 850.2100 |
Codorniz Bobwhite especies de paseriformes individuales recomendadas. |
Ver arriba |
Aves jóvenes aún no apareadas, de al menos 16 semanas de edad al inicio de la prueba. |
14 días |
Dosis oral única al inicio de la prueba |
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Toxicidad dietética subaguda * |
Codorniz Bobwhite, ánade real |
Ver arriba |
Ánadejo real: 5 días de edad Codorniz Bobwhite: 10-14 días de edad |
8 días |
5 días |
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Reproducción de una generación |
OCSPP 850.2200 |
Codorniz Bobwhite, ánade real, codorniz japonesa** |
Peso corporal adulto, consumo de alimentos, producción de óvulos, fertilidad, supervivencia embrionaria, tasa de eclosión, supervivencia de pollitos. |
Acercándose a la primera temporada de reproducción: Mallard (6 a 12 meses de edad) Codorniz Bobwhite 20 -24 semanas |
20 - 22 semanas |
10 semanas |
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Pruebas de evitación (ensayos con pluma) |
Lo más estrechamente relacionado posible con especies en riesgo; por ejemplo: gorrión paloma de roca, faisán, perdiz gris |
Ingesta de alimentos, mortalidad, Efectos subletales |
Adultos jóvenes si es posible (depende del diseño del estudio) |
De uno a varios días, dependiendo del diseño del estudio. |
De uno a varios días, dependiendo del diseño del estudio. |
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Prueba de disruptor endocrino de dos generaciones |
Codorniz japonesa |
Además de los criterios de valoración enumerados para el estudio de una generación: comportamiento sexual masculino, criterios de valoración bioquímicos, histológicos y morfológicos |
4 semanas después de la escotilla |
38 semanas |
8 semanas - adulto (F0) generación +14 semanas F1 generación. |
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Estudios de campo para refinar residuos de alimentos en evaluaciones de riesgo de aves de nivel superior. |
Apéndice N de la Guía de Aves y Mamíferos de la EFSA. |
Depende de las especies en riesgo en el son de uso de plaguicidas. |
Depende del diseño del estudio desarrollado. |
Incontrolable en un estudio de campo |
Depende del diseño del estudio desarrollado. |
Depende del diseño del estudio desarrollado. |
* Este estudio ya casi no se pide por todos.
** Solo en la directriz de la OCDE
Pruebas de toxicidad aguda
Para evaluar el riesgo a corto plazo para las aves, se deben realizar pruebas de toxicidad aguda para todos los plaguicidas (el ingrediente activo de los mismos) a los que es probable que las aves estén expuestas, dando como resultado un LD 50 (mg/kg cuerpo/día) (ver sección sobre las relaciones concentración-respuesta). La prueba de toxicidad oral aguda implica la administración por sonda o cápsula al inicio del estudio (Figura 2). Se debe tener cuidado al dosificar a las aves mediante alimentación oral. Algunas especies pueden regurgitar fácilmente, lo que genera incertidumbre en la dosis administrada. Estos incluyen pato silvestre, palomas y algunas especies de paseriformes. En el Cuadro 1 se presentan las especies de aves recomendadas en las directrices de la OCDE y la USEPA, respectivamente. Las aves de caza y los paseriformes son una buena combinación para tener en cuenta la filogenia y un buen punto de partida para comprender mejor la distribución de la sensibilidad de las especies.
La directriz 223 de la OCDE utiliza en promedio 26 aves y es un diseño secuencial (Edwards et al., 2017). Las respuestas de las aves a cada etapa de la prueba se combinan para estimar y mejorar la estimación de la LD 50 y pendiente. Las pruebas se pueden detener en cualquier etapa una vez que la precisión de la estimación LD 50 cumpla con los requisitos para la evaluación del riesgo, por lo tanto, se utilizan muchas menos aves para el cumplimiento de las 3R (reducción, refinamiento y reemplazo). Si se espera que la toxicidad sea baja, se dosifica a 5 aves a la dosis límite de 2000 mg/kg (que es la dosis más alta aceptable que se administra por sonda oral, desde un punto de vista humano). Si no hay mortalidad en la prueba límite después de 14 días el estudio está completo y el LD 50 >2000 mg/kg peso corporal. Si hay mortalidad, un solo individuo es tratado a cada una de las 4 dosis diferentes en la Etapa 1. Con estos resultados se determina una estimación de trabajo del LD 50 para seleccionar 10 niveles de dosis adicionales para una mejor estimación de la LD 50 en la Etapa 2. Si se requiere una pendiente, se requiere una Etapa 3 adicional utilizando 10 aves más en una combinación de dosis seleccionadas sobre la base de una estimación provisional de la pendiente.
La guía de la USEPA es un diseño de etapa única precedido por una prueba de búsqueda de rango (utilizada solo para establecer las concentraciones para la prueba principal). La prueba LD 50 utiliza 60 aves (10 a cada una de las cinco concentraciones de prueba y 10 aves en el grupo testigo). A pesar del alto número de aves utilizadas, la capacidad de estimar una pendiente es pobre en comparación con la OECD223 (la capacidad para calcular el LD 50 es similar a la directriz de la OCDE 223).
Pruebas de toxicidad dietética
Para la evaluación de riesgo a mediano plazo se realizó regularmente una prueba de toxicidad dietética aviar en el pasado exponiendo a jóvenes (pollitos) de codorniz, codorniz japonesa o ánade real a una dieta tratada. Esta prueba determina la concentración letal media (LC 50) de una sustancia química en respuesta a una exposición dietética de 5 días. Dadas las limitaciones científicas y preocupaciones de bienestar animal relacionadas con esta prueba (EFSA, 2009) la normativa europea vigente recomienda realizar esta prueba solo cuando se espera que el valor LD 50 medido por el estudio a mediano plazo sea inferior al LD 50 agudo i.e. si el químico es acumulativo en su efecto.
Pruebas de reproducción
Se solicitan pruebas de reproducción de una generación en codornices y/o ánades reales para el registro de todos los plaguicidas a los que es probable que las aves estén expuestas durante la época de reproducción. En el Cuadro 1 se presentan los dos estudios estándar: la Prueba 206 de la OCDE y el estudio US EPA OCSPP 850.2100. La sustancia a ensayar se mezcla en la dieta desde el inicio de la prueba. Las aves son alimentadas ad libitum por un periodo recomendado de 10 semanas antes de que comiencen a poner huevos en respuesta a un cambio en el fotoperiodo. El periodo de puesta de huevos debe durar al menos diez semanas. Los criterios de valoración incluyen peso corporal del adulto, consumo de alimentos, hallazgos macroscópicos en la necropsia y criterios reproductivos, con el número de pollos/patitos supervivientes de 14 días como criterio general de valoración.
La directriz de la OCDE establece que la codorniz japonesa (Coturnix coturnix japonica), también es aceptable.
Pruebas de evitación (o repelencia)
El comportamiento de evitación por parte de las aves en el campo podría considerarse como una reducción del riesgo de exposición a un pesticida y, por lo tanto, podría considerarse en la evaluación del riesgo. Sin embargo, la ocurrencia de evitación en el laboratorio tiene un efecto confuso sobre las estimaciones de toxicidad en estudios dietéticos (LD 50). Las pruebas de evitación hasta el momento tienen mayor relevancia en la evaluación del riesgo de los tratamientos de semillas. Es necesario tomar en cuenta una serie de factores, incluyendo la tasa de alimentación y la concentración dietética que pueden determinar si la evitación o la mortalidad es el resultado. El siguiente informe integral de la OCDE ofrece una visión general de las actividades de desarrollo de directrices e investigación que han tenido lugar hasta la fecha bajo la bandera de la OCDE. En ocasiones estos estudios se realizan como estudios de semi-campo (o pluma).
Pruebas de disruptores endocrinos
Las sustancias que alteran el sistema endocrino pueden definirse como materiales que causan efectos sobre la reproducción a través de la interrupción de procesos mediados por el sistema endocrino. Si hay razones para sospechar que una sustancia podría tener un efecto endocrino en aves, se podría realizar un diseño de prueba aviar de dos generaciones dirigido específicamente a la evaluación de los efectos endocrinos. Esta prueba ha sido desarrollada por la USEPA (OCSPP 890.210). Sin embargo, la prueba no ha sido aceptada como prueba de la OCDE hasta la fecha. Utiliza la codorniz japonesa como especie preferida. Las principales razones por las que se seleccionaron codornices japonesas para esta prueba fueron: 1) La codorniz japonesa es una especie precoz como se mencionó anteriormente. Esto significa que al nacer los polluelos de codorniz japoneses están mucho más lejos en su diferenciación y desarrollo sexual que los polluelos de especies altriciales. Los procesos hormonales que ocurren en las codornices japonesas en estas primeras etapas de desarrollo pueden verse alterados por químicos depositados maternalmente en el huevo (Ottinger y Dean, 2011). Por el contrario, las especies altriciales experimentan estas mismas etapas de desarrollo sexual después de la eclosión y pueden estar expuestas a sustancias químicas en los alimentos que podrían impactar estos mismos procesos hormonales. 2) como se mencionó anteriormente, los jóvenes del año maduran y se reproducen (ellos mismos) dentro de los 12 meses lo que hace que la prueba sea más eficiente que si usado codorniz bobwhite o ánade real.
Se argumenta entre los toxicólogos aviares, que es necesario desarrollar un sistema de ensayo endocrino de pinzón cebra, junto con el sistema de codorniz japonés, ya que esto permitirá una determinación más sistemática de las diferencias entre las respuestas a EDC en especies altriciales y precociales, al permitir una mejor evaluación y posterior evaluación del riesgo de posibles efectos endocrinos en aves. Las diferencias en el cuidado parental, el comportamiento de anidación y la territorialidad son ejemplos de aspectos que podrían incorporarse en dicho enfoque (Jones et al., 2013).
Estudios de campo:
Los estudios de campo pueden ser utilizados para probar efectos adversos en una variedad de especies simultáneamente, bajo condiciones de exposición real en el ambiente (Hart et al, 2001). El número de sitios y los campos y métodos de control (búsqueda de cadáveres, censos y radiotraqueos) requieren una cuidadosa consideración para un uso óptimo de los estudios de campo en toxicología aviar. El sitio de campo definirá las especies estudiadas y es importante considerar la relevancia de esa especie en otras localidades. Para mayor lectura sobre técnicas y métodos a utilizar en la investigación de campo aviar se recomiendan Sutherland et al y Bibby et al. (2000).
Referencias
Bibby, C., Jones, M., Marsden, S. (2000). Técnicas de campo de expedición Encuestas de aves. Birdlife Internacional.
Birdlife International (2018). El estado de las aves del mundo. https://www.birdlife.org/sites/default/files/attachments/BL_ReportENG_V11_spreads.pdf
Brooks, A.C., Freidora, M., Lawrence, A., Pascual, J., Sharp, R. (2017). Reflexiones sobre la evaluación del riesgo de aves y mamíferos para productos fitosanitarios en la Unión Europea: pasado, presente y futuro. Toxicología y Química Ambiental 36, 565-575.
Edwards, P.J., Leopold, A., Castores, J.B., Springer, T.A., Chapman, P., Maynard, S.K., Hubbard, P. (2017). Más o menos: Análisis del desempeño de la guía oral aguda aviar OCDE 223 a partir de datos empíricos. Evaluación y Gestión Ambiental Integrada 13, 906-914.
Hart, A., Balluff, D., Barfknecht, R., Chapman, P.F., Hawkes, T., Joermann, G., Leopold, A., Luttik, R. (Eds.) (2001). Evaluación de efectos aviares: un marco para estudios de contaminantes. Un informe de un taller de la SETAC sobre 'Enfoques armonizados para la evaluación de efectos aviares', realizado con el apoyo de la OCDE, en Woudschoten, Países Bajos, septiembre de 1999. Un libro de la SETAC.
Jones, P.D., Hecker, M., Wiseman, S., Giesy, J.P. (2013). Pájaros. Capítulo 10 En: Matthiessen, P. (Ed.) Interruptores Endocrinos - Pruebas de Peligros y Métodos de Evaluación. Wiley & Hijos.
Kendall, R.J., Lacher Jr, T.E. (Eds.) (1994). Toxicología de Vida Silvestre y Modelado de Poblaciones - Estudios Integrados de Agrochecosistemas Publicación Especial de SETAC.
Murk, A.J., Boudewijn, T.J., Meininger, P.L., Bosveld, A.T.C., Rossaert, G., Ysebaert, T., Meire, P., Dirksen, S. (1996). Efectos de hidrocarburos aromáticos polihalogenados y contaminantes relacionados sobre la reproducción del charrán común: Integración de datos biológicos, bioquímicos y químicos. Archivos de Contaminación Ambiental y Toxicología 31, 128-140.
Ottinger, M.A., Dean, K. (2011). Impactos neuroendocrinos de los productos químicos que alteran el sistema endocrino en aves: etapa de vida y sensibilidades de especies. Revista de Toxicología y Salud Ambiental, Parte B: Revisiones Críticas. 26 de julio de 2011.
Sutherland, W.J., Newton, I., Green, R.E. (Eds.) (2004). Ecología Biológica y Conservación. Un Manual de Técnicas. Prensa de la Universidad de Oxford
Dar tres razones por las que las aves son un modelo importante en ecotoxicología?
¿Cuál es el objetivo de las pruebas de toxicidad aviar?
¿Qué especies aviares son las más utilizadas y por qué?
¿Cuál es la diferencia entre especies precociales y altriciales?
¿Qué criterios de valoración se utilizan normalmente en las pruebas estandarizadas de toxicidad aviar?
Nombrar dos ejemplos de cómo se podría reducir la incertidumbre en la evaluación de los riesgos de químicos en las aves.
4.3.8. Pruebas de toxicidad in vitro
Autor: Timo Hamers
Revisor: Arno Gutleb
Objetivos de aprendizaje
Deberías ser capaz de:
- explicar la diferencia entre bioensayos in vitro e in vivo
- describir el principio de un ensayo de unión a ligando, un ensayo de inhibición enzimática y un bioensayo de gen indicador
- explicar la diferencia entre cultivos celulares primarios, líneas celulares finitas y líneas celulares continuas
- describir diferentes niveles en la potencia de diferenciación celular de totipotente a unipotente;
- indican cómo se pueden obtener cultivos celulares in vitro de células diferenciadas a partir de células madre embrionarias y de células madre pluripotentes inducidas
- dar ejemplos de criterios finales que se pueden medir en bioensayos basados en células
- discutir en sus propias palabras una perspectiva futura de las pruebas de toxicidad in vitro
Keywords: ensayo de unión a ligando; ensayo de inhibición enzimática; cultivo celular primario; línea celular; célula madre; órgano en chip
Introducción
Los bioensayos in vitro se refieren a métodos de prueba que hacen uso de tejidos, células o proteínas. El término “in vitro” (que significa “en vidrio”) se refiere a los tubos de ensayo o placas de Petri hechos de vidrio que tradicionalmente se utilizaron para realizar este tipo de pruebas de toxicidad. Hoy en día, los bioensayos in vitro se realizan con mayor frecuencia en placas de microtitulación de plástico que contienen múltiples (6, 12, 24, 48, 96, 384 o 1536) recipientes de prueba (llamados “pocillos”) por placa (Figura 1). Los bioensayos in vitro generalmente se realizan para seleccionar sustancias o muestras individuales para determinar propiedades bioactivas específicas. Como tal, la toxicología in vitro se refiere a la ciencia de analizar sustancias o muestras para determinar propiedades tóxicas específicas usando tejidos, células o proteínas.
La mayoría de los bioensayos in vitro muestran una respuesta específica de mecanismo, que es, por ejemplo, indicativa de la inhibición de una enzima específica o la activación de un receptor molecular específico. Además, los bioensayos in vitro generalmente se realizan en pequeños volúmenes de prueba y tienen una duración de prueba corta (generalmente los períodos de incubación varían de 15 minutos a 48 horas). Como consecuencia, se pueden probar múltiples muestras simultáneamente en un solo experimento y se pueden realizar múltiples experimentos en un período de prueba relativamente corto. “Esta característica de “" rendimiento medio "” de los bioensayos in vitro puede incluso aumentarse a alto rendimiento” si los pasos que limitan el tiempo en el procedimiento de prueba (por ejemplo, preparación de muestras, cultivo celular, pipeteado, lectura) se automatizan aún más.”
Las pruebas de toxicidad que hacen uso de bacterias también se realizan a menudo en pequeños volúmenes, lo que permite una duración de prueba corta y un alto rendimiento. Aún así, tales pruebas hacen uso de organismos intactos y, por lo tanto, deben considerarse estrictamente como bioensayos in vivo. Esto es especialmente cierto si las bacterias se utilizan para estudiar criterios de valoración como la supervivencia o el crecimiento de la población. Sin embargo, los sistemas de prueba de bacterias que estudian mecanismos tóxicos específicos, como la prueba de Ames utilizada para detectar propiedades mutagénicas de sustancias (ver sección Carcinogenicidad y Genotoxicidad), a menudo se consideran bioensayos in vitro, debido a la similitud en las características de la prueba cuando se comparan a pruebas de toxicidad in vitro con células derivadas de organismos superiores.
Ensayos basados en proteínas
La forma más simple de un ensayo de unión in vitro consiste en una proteína purificada que se incuba con una sustancia o muestra tóxica potencial. Las proteínas purificadas generalmente se obtienen por aislamiento de un organismo intacto o de cultivos de bacterias recombinantes, las cuales se modifican genéticamente para expresar la proteína de interés.
Los ensayos de unión al ligando se utilizan para determinar si la sustancia de ensayo es capaz de unirse a la proteína, inhibiendo así la capacidad de unión del ligando natural (endógeno) a esa proteína (ver sección sobre Inactivación de Proteínas). Las proteínas de interés son, por ejemplo, proteínas receptoras o proteínas transportadoras. Los ensayos de unión a ligando a menudo hacen uso de un ligando natural que ha sido marcado con un isótopo radiactivo. La proteína se incuba con el ligando marcado en presencia de diferentes concentraciones de la sustancia problema. Si la unión a proteínas por la sustancia de ensayo impide la unión del ligando a la proteína, el ligando libre muestra un aumento de la radiactividad dependiente de la concentración (Ver Figura 2). En consecuencia, el complejo ligando-proteína muestra una disminución de la radiactividad dependiente de la concentración. Alternativamente, el ligando natural puede marcarse con un grupo fluorescente. La unión de dicho ligando marcado a la proteína a menudo causa un aumento en la fluorescencia. En consecuencia, se observa una disminución en la fluorescencia si una sustancia de ensayo impide la unión del ligando a la proteína.
Los ensayos de inhibición enzimática se utilizan para determinar si una sustancia de ensayo es capaz de inhibir la actividad enzimática de una proteína. La actividad enzimática generalmente se determina como la tasa de conversión de un sustrato en un producto. La inhibición enzimática se determina como una disminución en la tasa de conversión, correspondiente a concentraciones menores de producto y mayores concentraciones de sustrato después de diferentes periodos de incubación. Las medidas cuantitativas de la desaparición del sustrato o la formación del producto se pueden realizar mediante análisis químico del sustrato o del producto. Preferiblemente, sin embargo, la velocidad de reacción se mide por espectrofotometría o por fluorescencia. Esto se logra realizando la reacción con un sustrato que tiene un color específico o fluorescencia por sí mismo o que produce un producto con un color o fluorescencia específicos, en algunos casos después de la reacción con un compuesto indicador adicional. Un ejemplo bien conocido de un ensayo de inhibición enzimática es el ensayo de inhibición de acetilcolinesterasa (ver sección Diagnóstico - Bioensayos in vitro).
Cultivos celulares
Los bioensayos basados en células hacen uso de cultivos celulares que se mantienen en el laboratorio. El cultivo celular comienza con el aislamiento mecánico o enzimático de células individuales de un tejido (obtenido de un animal o una planta). Posteriormente, las células se cultivan en medio de cultivo celular, es decir, un líquido que contiene todos los nutrientes esenciales necesarios para un crecimiento celular óptimo (por ejemplo, factores de crecimiento, vitaminas, aminoácidos) y regula el ambiente fisicoquímico de las células (por ejemplo, tampón de pH, salinidad). Típicamente, se pueden distinguir varios tipos de cultivos celulares (Figura 3).
Los cultivos celulares primarios consisten en células que se aíslan directamente de un organismo donante y se mantienen in vitro. Típicamente, tales cultivos celulares consisten en una suspensión celular de células no adherentes o una monocapa de células adherentes unidas a un sustrato (es decir, a menudo el fondo del recipiente de cultivo). Las células pueden sufrir varias divisiones celulares hasta que la suspensión celular se vuelve demasiado densa o las células adherentes crecen una encima de la otra. Las células se pueden subcultivar posteriormente transfiriendo parte de las células del cultivo primario a un nuevo recipiente de cultivo que contiene medio fresco. Esta progenie del cultivo celular primario se denomina línea celular, mientras que el evento de subcultivo se denomina pase. Típicamente, las líneas celulares derivadas de células primarias experimentan senescencia y dejan de proliferar después de un número limitado (20-60) de divisiones celulares. En consecuencia, una línea celular finita de este tipo puede sufrir solo un número limitado de pasajes. Los cultivos celulares primarios y sus líneas celulares finitas posteriores tienen la ventaja de que se asemejan mucho a la fisiología de las células in vivo. La desventaja de tales cultivos celulares para las pruebas de toxicidad es que se dividen relativamente lentamente, requieren condiciones específicas de cultivo celular y son finitos. Los nuevos cultivos solo se pueden obtener de nuevos organismos donantes, lo que lleva mucho tiempo, es costoso y puede introducir variaciones genéticas.
Alternativamente, se han establecido líneas celulares continuas, las cuales tienen una vida indefinida debido a que las células son inmortales. Debido a mutaciones genéticas, las células de una línea celular continua pueden sufrir un número indefinido de divisiones celulares y comportarse como células cancerosas. Las mutaciones inmortalizantes pueden haber estado presentes en el cultivo celular primario original, si estas células se aislaron de un tejido tumoral canceroso maligno. Alternativamente, la línea celular finita original puede haberse transformado en una línea celular continua mediante la introducción de una mutación inducida viral o química. La ventaja de las líneas celulares continuas es que las células proliferan rápidamente y son fáciles de cultivar y manipular (por ejemplo, mediante modificación genética). La desventaja es que las líneas celulares continuas tienen un genotipo y fenotipo diferentes a los de las células sanas originales in vivo (por ejemplo, han perdido la capacidad enzimática) y se comportan como células cancerosas (por ejemplo, han perdido sus capacidades diferenciadoras y su capacidad para formar uniones estrechas).
Modelos de diferenciación
Para estudiar los efectos tóxicos de los compuestos in vitro, los toxicólogos prefieren utilizar cultivos celulares que se asemejen a células diferenciadas y sanas en lugar de células cancerosas indiferenciadas. Por lo tanto, los modelos de diferenciación han ganado cada vez más atención en toxicología in vitro en los últimos años. Dichos modelos de diferenciación se basan en células madre, que son células que poseen la potencia para diferenciarse en células somáticas. Las células madre se pueden obtener de tejidos embrionarios en diferentes etapas de desarrollo normal, cada una con su propia potencia para diferenciarse en células somáticas (ver Figura 1 en Berdasco y Esteller, 2011). En la etapa embrionaria muy temprana, las células de la “etapa de mórula” (es decir, después de algunas divisiones celulares del cigoto) son totipotentes, lo que significa que pueden diferenciarse en todos los tipos celulares de un organismo. Posteriormente en el desarrollo, las células de la masa celular interna del trofoblasto son pluripotentes, lo que significa que pueden diferenciarse en todos los tipos celulares, excepto en las células extraembrionarias. Durante la gastrulación, las células de las diferentes capas germinales (es decir, ectodermo, mesodermo y endodermo) son multipotentes, lo que significa que pueden diferenciarse en un número restringido de tipos celulares. La diferenciación adicional da como resultado células precursoras que son unipotentes, lo que significa que están comprometidas a diferenciarse en un único tipo de célula diferenciada final.
Si bien permanecen indiferenciados, los cultivos de células madre embrionarias (ESC) in vitro pueden dividirse indefinidamente, porque no sufren de senescencia. Sin embargo, una línea celular ESC no puede considerarse como una línea celular continua (o inmortalizada), porque las células no contienen mutaciones genéticas. Las ESC pueden diferenciarse en el tipo celular de interés manipulando las condiciones de cultivo celular de tal manera que se estimulen o inhiban vías de señalización específicas en la misma secuencia que ocurre durante la diferenciación de tipo celular in vivo. La manipulación puede consistir en la adición de factores de crecimiento, factores de transcripción, citocinas, hormonas, factores de estrés, etc. Este enfoque requiere una buena comprensión de qué factores afectan los pasos de decisión en el linaje celular del tipo celular de interés.
La diferenciación de ESC en células diferenciadas no solo es aplicable en pruebas de toxicidad in vitro, sino también en el descubrimiento de fármacos, medicina regenerativa y modelado de enfermedades. Aún así, la destrucción de un embrión humano con el propósito de aislar -principalmente pluripotentes- ESC humanas (hESC) plantea cuestiones éticas. Por lo tanto, se han explorado fuentes alternativas de hESC. El aislamiento y posterior diferenciación in vitro de células madre multipotentes a partir de líquido amniótico (recolectado durante cesáreas), sangre de cordón umbilical y médula ósea adulta es un campo de investigación muy tópico.
Un desarrollo revolucionario en el campo de los modelos de diferenciación de células madre no embrionarias fue el descubrimiento de que las células diferenciadas pueden ser reprogramadas a células indiferenciadas con capacidades pluripotentes, llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPSC) (Figura 4). En 2012, el Premio Nobel de Fisiología o Medicina fue otorgado a John B. Gurdon y Shinya Yamanaka por este descubrimiento pionero. La reprogramación de células diferenciadas aisladas de un donante adulto se obtiene exponiendo las células a una mezcla de factores de reprogramación, que consiste en factores de transcripción típicos de células madre pluripotentes. Las iPSC obtenidas pueden diferenciarse nuevamente (similares a las ESC) en cualquier tipo de células diferenciadas, para lo cual se conocen las condiciones requeridas para el linaje celular y se pueden simular in vitro.
Mientras que los modelos de diferenciación basados en iPSC requieren una reprogramación completa de una célula somática diferenciada de vuelta al nivel de células madre, la transdiferenciación (o reprogramación de linaje) es una técnica alternativa mediante la cual las células somáticas diferenciadas pueden transformarse en otra tipo de células somáticas diferenciadas, sin someterse a una etapa pluripotente intermedia. Especialmente las líneas celulares de fibroblastos son conocidas por su capacidad para ser transdiferenciadas en diferentes tipos celulares, como neuronas o adipocitos (Figura 5).
Bioensayos basados en células
En bioensayos in vitro basados en células, los cultivos celulares se exponen a compuestos o muestras de prueba y se mide su respuesta. En principio, todos los tipos de modelos de cultivo celular discutidos anteriormente pueden usarse para pruebas de toxicidad in vitro. Por razones de tiempo, dinero y comodidad, se utilizan comúnmente líneas celulares continuas, pero cada vez más a menudo se utilizan líneas celulares primarias y líneas celulares derivadas de iPSC, por razones de mayor relevancia biológica. Los criterios de valoración que se miden en cultivos celulares in vitro expuestos a compuestos tóxicos suelen variar desde los efectos sobre la viabilidad celular (medidos como disminución del funcionamiento mitocondrial, aumento del daño de la membrana o cambios en el metabolismo celular; ver sección sobre Citotoxicidad) y crecimiento celular hasta efectos sobre las células cinética (absorción, eliminación y biotransformación de sustratos celulares), cambios en el transcriptoma celular, proteoma o metaboloma, o efectos sobre el funcionamiento dependiente del tipo celular. Además, los modelos de diferenciación celular pueden ser utilizados no sólo para estudiar los efectos de los compuestos sobre las células diferenciadas, sino también para estudiar los efectos sobre el proceso de diferenciación celular per se mediante la exposición de las células durante la diferenciación.
Un tipo específico de bioensayos basados en células son los bioensayos de genes informadores, que a menudo se utilizan para cribar compuestos individuales o mezclas complejas extraídas de muestras ambientales para determinar su potencia para activar o inactivar receptores que desempeñan un papel en la expresión de genes que desempeñan un papel importante en un camino específico. Los bioensayos de genes indicadores hacen uso de líneas celulares modificadas genéticamente o bacterias que contienen una construcción génica incorporada que codifica una proteína fácilmente medible (es decir, la proteína indicadora). Esta construcción génica se desarrolla de tal manera que su expresión se desencadena por una interacción específica entre el compuesto tóxico y un receptor celular. Si el receptor es activado por el compuesto tóxico, tiene lugar la transcripción y traducción de la proteína indicadora, la cual puede medirse fácilmente como un cambio de color, fluorescencia o luminiscencia (ver sección Diagnóstico - Bioensayos in vitro).
Desarrollos futuros
Aunque existe una necesidad social de un ambiente no tóxico, también existe una demanda social de estudios de R educe, R efine y R eplace animales (tres principios R). La sustitución de estudios en animales por pruebas in vitro requiere que los resultados obtenidos in vitro sean indicativos y predictivos de lo que ocurre en la situación in vivo. Es obvio que un cultivo celular que consiste en un solo tipo celular no es comparable a un organismo complejo. Por ejemplo, los aspectos toxicocinéticos apenas se tienen en cuenta en los bioensayos basados en células. Aunque algunas células pueden tener capacidades metabólicas, procesos como adsorción, distribución y eliminación no se representan ya que la exposición suele ser directamente sobre las células. Además, los cultivos celulares a menudo carecen de mecanismos de reparación, bucles de retroalimentación y cualquier otra interacción con otros tipos de células/tejidos/órganos que se encuentran en organismos intactos. Para ampliar el alcance de la extrapolación in vitro - in vivo (IVIVE), hoy en día se desarrollan modelos in vitro más complejos que tienen un parecido más cercano a la situación in vivo. Por ejemplo, mientras que el cultivo celular se realizó tradicionalmente en monocapas 2D (es decir, en capas de 1 grosor celular), el cultivo celular 3D está ganando terreno. La ventaja del cultivo 3D es que representa un tipo de crecimiento celular más realista, incluyendo interacciones célula-célula, polarización, diferenciación, matriz extracelular, gradientes de difusión, etc. Para las células epiteliales (por ejemplo, células pulmonares), tales cultivos 3D pueden incluso cultivarse en la interfase aire-líquido. reflejando la situación in vivo. Otro desarrollo es el cocultivo celular donde diferentes tipos de células se cultivan juntos en un cultivo celular. Por ejemplo, se pueden cocultivar dos tipos de células que interactúan en un órgano. Alternativamente, un tipo de célula diferenciada que tiene poca capacidad metabólica se puede cocultivar con una célula hepática para tener en cuenta una posible desintoxicación o bioactivación después de la biotransformación. El último desarrollo en complejidad creciente en sistemas de pruebas in vitro son los llamados dispositivos de órgano en un chip, en los que diferentes tipos de células se co-cultivan en pequeños canales miniaturizados. Las células pueden estar expuestas a diferentes flujos que representan, por ejemplo, el torrente sanguíneo, que puede contener compuestos tóxicos (ver, por ejemplo, videoclips en https://wyss.harvard.edu/technology/human-organs-on-chips/). Con base en técnicas similares, incluso se pueden construir dispositivos de cuerpo humano en un chip. Dichos chips contienen diferentes compartimentos miniaturizados que contienen cocultivos celulares que representan diferentes órganos, los cuales están todos interconectados por diferentes canales que representan un sistema circulatorio de microfluidos (Figura 6). Si bien dichos dispositivos están en sus infancias y regularmente tropiezan con impracticalidades, es de esperar que estos desarrollos innovadores jueguen su parte en un futuro próximo de las pruebas de toxicidad.
¿Cuál es el principio de un ensayo de unión a ligando?
¿Cuál es el principio de un ensayo de inhibición enzimática?
¿Cuál es el principio de un bioensayo de gen reportero?
¿Cuáles son las ventajas y desventajas de los cultivos celulares primarios frente a las líneas celulares continuas?
¿Cuál es la diferencia entre las células madre embrionarias y las células madre pluripotentes inducidas?
4.3.9. Pruebas de toxicidad humana - I. Aspectos generales
En preparación
4.3.9. Pruebas de toxicidad humana - II. Pruebas in vitro
(Borrador)
Autor: Nelly Saenen
Críticos: Karen Smeets, Frank Van Belleghem
Objetivos de aprendizaje:
Deberías ser capaz de
- argumentar la necesidad de métodos de ensayo alternativos para la toxicidad
- enumerar los ensayos de citotoxicidad in vitro de uso común y explicar cómo funcionan
- describir diferentes tipos de toxicidad para la piel y métodos de ensayo in vitro para evaluar este tipo de toxicidad
Palabras clave: In vitro, toxicidad, citotoxicidad, piel
Introducción
Se requieren pruebas de toxicidad para evaluar los peligros potenciales de nuevos compuestos para los humanos. Estas pruebas revelan efectos tóxicos específicos de especies, órganos y dosis del compuesto bajo investigación. La toxicidad se puede observar mediante estudios in vitro utilizando células/líneas celulares (ver sección sobre bioensayo in vitro) o por exposición in vivo en animales de laboratorio; e implica diferentes duraciones de exposición (aguda, subcrónica y crónica). De conformidad con la Directiva 2010/63/CE sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos, se alienta el uso de alternativas a los ensayos con animales (OCDE: métodos alternativos para las pruebas de toxicidad). El primer paso hacia la sustitución de animales es utilizar métodos in vitro que puedan ser utilizados para predecir la toxicidad aguda. En este capítulo, presentamos pruebas de citotoxicidad aguda in vitro (= calidad de ser tóxico para las células) y pruebas cutáneas corrosivas, irritantes, fototóxicas y de sensibilidad, ya que la piel es el órgano más grande del cuerpo.
- Pruebas de citotoxicidad
La prueba de citotoxicidad es una de las pruebas de evaluación biológica y tamizaje in vitro para observar la viabilidad celular. Los niveles de viabilidad de las células son buenos indicadores de salud celular. Las pruebas de citotoxicidad utilizadas convencionalmente incluyen ensayos de exclusión o absorción de colorantes tales como Exclusión de Azul de Tripano (TBE) y Absorción de Rojo Neutro (NRU).
La prueba TBE se utiliza para determinar el número de células viables presentes en una suspensión celular. Las células vivas poseen membranas celulares intactas que excluyen ciertos colorantes, como el azul de tripano, mientras que las células muertas no. En este ensayo, una suspensión celular incubada con diluciones seriadas de un compuesto de ensayo en estudio se mezcla con el colorante y luego se examina visualmente. Una célula viable tendrá un citoplasma claro mientras que una célula no viable tendrá un citoplasma azul. El número de células viables y/o muertas por unidad de volumen se determina mediante microscopía óptica utilizando una cámara de conteo de hemacitómetro (Figura 1). Este método es simple, económico y un buen indicador de integridad de la membrana pero pueden ocurrir errores de conteo (~ 10%) debido a la mala dispersión de las células, o al llenado inadecuado de la cámara de conteo.
El ensayo NRU es un enfoque que evalúa la captación celular de un colorante (Rojo Neutro) en presencia de una sustancia particular en estudio (ver por ejemplo, Figura 1 en Repetto et al., 2008). Esta prueba se basa en la capacidad de las células viables para incorporar y unir rojo neutro en los lisosomas, un proceso basado en estructuras y funciones universales de las células (por ejemplo, integridad de la membrana celular, producción y metabolismo de energía, transporte de moléculas, secreción de moléculas). Las células viables pueden tomar rojo neutro a través del transporte activo e incorporar el colorante en sus lisosomas mientras que las células no viables no pueden. Después del lavado, las células viables pueden liberar el colorante incorporado en condiciones de extracción acidificada. La cantidad de tinte liberado se puede medir mediante el uso de espectrofotometría.
Hoy en día, los ensayos colorimétricos para evaluar la viabilidad celular se han vuelto populares. Por ejemplo, el ensayo MTT (bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) prueba la viabilidad celular evaluando la actividad de las enzimas mitocondriales. Las enzimas oxidorreductasa dependientes de NAD (P) H, que bajo condiciones definidas reflejan el número de células viables, son capaces de reducir el colorante de sal de formazán amarillo en un producto cristalino púrpura insoluble. Después de solubilizar el producto final usando dimetilsulfóxido (DMSO), el producto se puede medir cuantitativamente por absorbancia de luz a una longitud de onda específica. Este método es fácil de usar, seguro y altamente reproducible. Una desventaja es que el formazán MTT es insoluble por lo que se requiere DMSO para solubilizar los cristales.
2. Corrosión e irritación cutánea
La corrosión cutánea se refiere a la producción de daños irreversibles en la piel; es decir, necrosis visible (= muerte localizada de células vivas, ver sección sobre muerte celular) a través de la epidermis y dentro de la dermis que ocurre después de la exposición a una sustancia o mezcla. La irritación cutánea es un efecto menos severo en el que se observa una reacción inflamatoria local sobre la piel después de la exposición a una sustancia o mezcla. Ejemplos de estas sustancias son detergentes y álcalis que comúnmente afectan a las manos.
La identificación y clasificación de sustancias irritantes se ha logrado convencionalmente mediante observación cutánea u ocular in vivo. Las pruebas tradicionales con animales utilizaron conejos debido a su fina piel. En la prueba de Draize, por ejemplo, la sustancia de prueba se aplica al ojo o piel afeitada de un conejo, y se cubre durante 24h. Después de 24 y 72 h, el ojo o la piel se examina visualmente y se gradúa subjetivamente en función de la aparición de eritema y edema. Como estas pruebas in vivo han sido fuertemente criticadas, ahora se están eliminando gradualmente en favor de alternativas in vitro.
La Prueba de Corrosión de la Piel (SCT) y la Prueba de Irritación de la Piel (SIT) son ensayos in vitro que pueden usarse para identificar si una sustancia química tiene el potencial de corroer o irritar la piel. El método utiliza un modelo tridimensional (3D) de piel humana (modelo Episkin) que comprende una capa basal principal, suprabásica, espinosa y granular y un estrato córneo funcional (la capa barrera externa de la piel). Implica la aplicación tópica de una sustancia de prueba y posterior evaluación de la viabilidad celular (ensayo MTT). Los compuestos de prueba considerados corrosivos o irritantes se identifican por su capacidad para disminuir la viabilidad celular por debajo del nivel umbral definido (dosis letal por la cual el 50% de las células aún son viables - LD 50).
3. Fototoxicidad cutánea
La fototoxicidad (fotoirritación) se define como una respuesta tóxica que se provoca después de la exposición inicial de la piel a ciertos productos químicos y posterior exposición a la luz (por ejemplo, productos químicos que absorben energía de luz visible o ultravioleta (UV) que induce cambios moleculares tóxicos).
El ensayo 3T3 NRU PT se basa en una línea celular de fibroblastos de ratón inmortalizada llamada BALB/c 3T3. Compara la citotoxicidad de un químico en presencia o ausencia de una dosis no citotóxica de luz solar simulada. La prueba expresa la reducción dependiente de la concentración de la captación del colorante vital rojo neutro cuando se mide 24 horas después del tratamiento con la irradiación química y de luz. La exposición a la irradiación puede alterar la superficie celular y, por lo tanto, puede resultar en una disminución de la captación y unión del rojo neutro. Estas diferencias se pueden medir con un espectrofotómetro.
4. Sensibilización cutánea
La sensibilización de la piel es el punto final regulador que apunta a la identificación de sustancias químicas capaces de provocar una respuesta alérgica en individuos susceptibles. En el pasado, la sensibilización cutánea se había detectado por medio de cobayas (por ejemplo, prueba de maximización de conejillos de indias y pruebas de parche ocluido de Buehler) o murinos (por ejemplo, ensayo de ganglios linfáticos locales murinos). Este último se basa en la cuantificación de la proliferación de células T en los ganglios linfáticos drenantes detrás de la oreja (auricular) de ratones después de la aplicación tópica repetida del compuesto de prueba.
Los eventos biológicos clave (Figura 2) que sustentan el proceso de sensibilización de la piel están bien establecidos e incluyen:
- haptenación, la unión covalente de los compuestos químicos (haptenos) a proteínas de la piel (evento clave 1);
- la señalización, la liberación de citocinas proinflamatorias y la inducción de vías citoprotectoras en los queratinocitos (evento clave 2);
- la maduración y movilización de células dendríticas, células inmunocompetentes en la piel (evento clave 3);
- migración de células dendríticas, movimiento de células dendríticas que portan hapteno-proteína se queja de la piel al ganglio linfático local drenante;
- la presentación de antígeno a células T vínicas y proliferación (expansión clonal) de células T específicas de hapteno-péptido (evento clave 4)
Figura en preparación
Figura 2: Eventos biológicos clave en la sensibilización cutánea. Figura adaptada de ...
Hoy en día se puede emplear una serie de métodos no animales que abordan cada uno un mecanismo clave específico de la fase de inducción de la sensibilización de la piel. Estos incluyen el ensayo de reactividad peptídica directa (DPRA), método de prueba de luciferasa ARE-NRF2: queratinosenos, prueba de activación de línea celular humana (H-clat), prueba de activación de línea celular U937 (U-SENS) y ensayo de gen indicador de interleucina-8 (ensayo IL-8 Luc). La información detallada de estos métodos se puede encontrar en el sitio de la OCDE: sensibilización de la piel.
Referencias
Sitio EUR-Lex. https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX:32010L0063
Sitio de la OCDE. Métodos alternativos para pruebas de toxicidad. https://ec.europa.eu/jrc/en/eurl/ecvam/alternative-methods-toxicity-testing
Modelo Episkin. http://www.episkin.com/Episkin
Sitio de la OCDE. Sensibilización cutánea. https://ec.europa.eu/jrc/en/eurl/ecvam/alternative-methods-toxicity-testing/validated-test-methods/skin-sensitisation
Repetto, G., Del Peso, A., Zurita, J.L. (2008). Ensayo de captación de rojo neutro para la estimación de la viabilidad celular/citotoxicidad.Protocolos de naturaleza 3 (7), 1125.
4.3.9. Pruebas de toxicidad humana - III. Ensayos de carcinogenicidad
(Borrador)
Autor: Jan-Pieter Ploem
Revisores: Frank van Belleghem
Objetivos de aprendizaje:
Deberías ser capaz de
- explicar los diferentes enfoques utilizados para las pruebas de carcinógenos.
- enumerar algunas ventajas y desventajas de los diferentes métodos
- comprender la diferencia entre los compuestos GTX y NGTX, y sus consecuencias con respecto a las pruebas de toxicidad
Introducción
El término “carcinogenicidad” se refiere a la propiedad de una sustancia para inducir o aumentar la incidencia de cáncer después de la inhalación, ingestión, inyección o aplicación dérmica.
Tradicionalmente, los carcinógenos se han clasificado según su modo de acción (MoA). Los compuestos que interactúan directamente con el ADN, dando como resultado daños en el ADN o aberraciones cromosómicas se clasifican como carcinógenos genotóxicos (GTX). Los compuestos no genotóxicos (NGTX) no afectan directamente al ADN y se cree que afectan la expresión génica, la transducción de señales, alteran las estructuras celulares y/o alteran la regulación del ciclo celular.
La diferencia en el mecanismo de acción entre GTX y NGTX requiere un enfoque diferente en muchos casos.
Carcinógenos genotóxicos
La genotoxicidad en sí misma se considera un criterio de valoración por derecho propio. La ocurrencia de daño al ADN se puede observar/determinar el abandono fácilmente mediante una variedad de métodos basados en células bacterianas y de mamíferos. A menudo se utiliza un método de prueba escalonado para evaluar tanto el daño heredable de la línea celular germinal como la carcinogenicidad.
Actualmente se han otorgado las directrices de la OCDE a ocho ensayos in vitro, cuatro de los cuales son de uso común.
- La prueba de Ames
El estándar de oro para las pruebas de genotoxicidad es la prueba de Ames, una prueba que se ha desarrollado a principios de los setenta. La prueba evalúa el potencial de una sustancia química para inducir mutaciones (sustituciones de pares de bases, inducción de desplazamiento de marco, estrés oxidativo, etc.) en Salmonella typhimurium. Durante el proceso de evaluación de seguridad, es la primera prueba realizada a menos que se considere inadecuada por razones específicas (por ejemplo, durante las pruebas de sustancias antibacterianas). Con una sensibilidad de 70-90% es un predictor relativamente bueno de genotoxicidad.
El principio de la prueba es bastante simple. Una cepa bacteriana, con un defecto genético, se coloca en un medio mínimo que contiene el químico en cuestión. Si se inducen mutaciones, se restablecerá el defecto genético en algunas células, haciendo así que las células sean capaces de sintetizar el aminoácido deficiente causado por el defecto en las células originales.
- Ensayo de mutación inversa de Escherichia coli
El ensayo de Ames es básicamente un ensayo de mutación inversa bacteriana. En este caso se utilizan diferentes cepas de E. coli, las cuales son deficientes tanto en la reparación del ADN como en un aminoácido, para identificar sustancias químicas genotóxicas. A menudo se utiliza una combinación de diferentes cepas bacterianas para aumentar la sensibilidad tanto como sea posible.
- Ensayo in vitro de aberración cromosómica en mamíferos
Las mutaciones cromosómicas pueden ocurrir tanto en células somáticas como en células germinales, dando lugar a neoplasia o anomalías de nacimiento y desarrollo respectivamente. Hay dos tipos de mutaciones cromosómicas:
Cambios estructurales: aberraciones estables como translocaciones e inversiones, y aberraciones inestables como brechas y roturas.
Cambios numéricos: aneuploidía (pérdida o ganancia de cromosomas) y poliploidía (múltiplos del complemento cromosómico diploide).
Para realizar el ensayo, las células de mamífero se exponen in vitro al carcinógeno potencial y luego se cosechan. Mediante microscopía se determina la frecuencia de aberraciones. La aberración cromosómica puede ser y se realiza tanto con células de roedores como humanas, lo que es una hazaña interesante con respecto al poder de traducción del ensayo.
- Prueba de mutación génica in vitro de células de mamífero
Este ensayo de genotoxicidad en mamíferos utiliza el gen HPRT, un gen informador localizado en el cromosoma X. La prueba se basa en que las células con un gen HPRT intacto son susceptibles a los efectos tóxicos de la 6-tioguanina, mientras que los mutantes son resistentes a este análogo de purina. Las células de tipo silvestre son sensibles al efecto citostático del compuesto mientras que los mutantes podrán proliferar en presencia de 6-tioguanina.
- Prueba de micronúcleos
Junto a los cuatro ensayos mencionados, existe una prueba desarrollada más reciente que ya ha demostrado ser un recurso valioso para las pruebas de genotoxicidad. La prueba proporciona una alternativa al ensayo de aberración cromosómica pero puede evaluarse más rápido. La prueba permite la medición automatizada ya que el análisis del daño resulta ser menos subjetivo. Los micronúcleos son núcleos “secundarios” formados como resultado de daños aneugénicos o clastogénicos.
Es importante señalar que todos estos ensayos se describen desde una perspectiva in vivo. Sin embargo, siempre se puede usar un enfoque in vivo, ver ensayo de roedores de dos años. En ese caso, los animales vivos se exponen al compuesto después de lo cual se cosechan células específicas. La ventaja de este enfoque es la presencia del nicho natural en el que normalmente crecen células susceptibles, resultando en una gama de efectos más relevante. La desventaja de los ensayos in vivo es la presión ética actual sobre este tipo de métodos. Varias instancias promueven activamente el desarrollo y uso de métodos alternativos in vitro o simplemente no animales.
- Ensayo de carcinogenicidad de roedores de dos años
Durante más de 50 años, el ensayo de carcinogenicidad de roedores de 2 años ha sido el estándar de oro para las pruebas de carcinogenicidad. El ensayo se basa en la exposición a un compuesto durante la mayor parte de la vida útil de un organismo. Durante el desarrollo posterior del ensayo, una configuración de 2 especies/2 géneros se convirtió en el método preferido, ya que algunos compuestos mostraron resultados diferentes en, por ejemplo, ratas y ratones e incluso entre individuos machos y hembras.
Para este enfoque, los organismos modelo se exponen durante dos años a un compuesto. Dependiendo del posible modo de exposición (es decir, inhalación, ingestión, piel/ojo/... contacto) cuando los compuestos ingresan a la industria relevante, se elige un modo específico de exposición hacia el modelo. Durante este periodo de tiempo se documenta la salud del organismo modelo a través de diferentes parámetros. A partir de esto se extrae una conclusión con respecto al compuesto.
Carcinógenos no genotóxicos
Los carcinógenos que no causan daño directo al ADN se clasifican como compuestos NGTX. Debido a que existe una gran cantidad de posibles vías malignas o efectos que podrían inducirse, la identificación de carcinógenos de NGTX es significativamente más difícil en comparación con los compuestos GTX.
El ensayo de carcinogenicidad de roedores a dos años es uno de los ensayos capaces de identificar con precisión los compuestos de NGTX. El uso de modelos transgénicos ha incrementado en gran medida la sensibilidad y especificidad de este ensayo hacia ambos grupos de carcinógenos, al tiempo que mejora el refinamiento del ensayo al acortar el tiempo requerido para formular una conclusión con respecto al compuesto.
Un método in vitro para identificar compuestos de NGTX es raro. No muchos ensayos alternativos son capaces de hacer frente a la gran variedad de posibles efectos causados por los compuestos dando como resultado muchos falsos negativos. Sin embargo, los métodos basados en la morfología celular, como el ensayo de transformación celular, pueden ser un buen comienzo en el desarrollo de métodos para este tipo de carcinógenos.
Referencias
Stanley, L. (2014). Toxicología Molecular y Celular. p. 434.
4.3.10. Epidemiología ambiental - I. Principios básicos y diseños de estudio
Autores: Eva Sugeng y Lily Fredrix
Revisores: Ãubica Murínová y Raymond Niesink
Objetivos de aprendizaje:
Deberías ser capaz de
- describir y aplicar definiciones de investigación epidemiológica.
- nombrar e identificar diseños de estudio en epidemiología, describir el diseño y ventajas e inconvenientes del diseño.
1. Definiciones de epidemiología
Epidemiología (originaria del griego antiguo: Epi -upon, demos - personas, logos - el estudio de) es el estudio de la distribución y determinantes de estados o eventos relacionados con la salud en poblaciones específicas, y la aplicación de este estudio a la prevención y control de problemas de salud (Last, 2001). Los epidemiólogos estudian poblaciones humanas con mediciones en uno o más momentos en el tiempo. Cuando un grupo de personas es seguido a lo largo del tiempo, llamamos a esto una cohorte (originaria del latín: cohores (latín), un grupo de soldados romanos). En epidemiología, se investiga la relación entre un determinante o factor de riesgo y la variable desenlace de salud. La variable de resultado se refiere principalmente a la morbilidad: una enfermedad, por ejemplo, cáncer de pulmón, o un parámetro de salud, por ejemplo, presión arterial, o mortalidad: muerte. El determinante se define como un factor de riesgo colectivo o individual (o conjunto de factores) que está (causalmente) relacionado con una condición de salud, resultado u otra característica definida. En la salud humana -y, específicamente, en enfermedades de etiología compleja-, los conjuntos de determinantes suelen actuar conjuntamente en procesos relativamente complejos y de largo plazo (International Epidemiological Association, 2014).
Las personas que son objeto de interés son la población objetivo. En la mayoría de los casos, es imposible e innecesario incluir a todas las personas de la población objetivo y por lo tanto, se tomará una muestra de la población objetivo, que se denomina población de estudio. La muestra es idealmente representativa de la población objetivo (Figura 1). Para obtener una muestra representativa, es posible reclutar sujetos al azar.
2. Diseños de estudio
La investigación epidemiológica puede ser observacional o experimental (Figura 2). Los estudios observacionales no incluyen interferencia (por ejemplo, asignación de sujetos en grupos expuestos/no expuestos), mientras que los estudios experimentales sí. Con respecto a los estudios observacionales se pueden distinguir estudios analíticos y descriptivos. Los estudios descriptivos describen el (los) determinante (es) y el resultado sin hacer comparaciones, mientras que los estudios analíticos comparan ciertos grupos y derivan inferencias.
2.1 Estudios observacionales
2.1.1. Estudio transversal
En un estudio transversal, se miden al mismo tiempo el determinante y el resultado. Por ejemplo, los niveles de plaguicidas en la orina (determinante) y los niveles hormonales en el suero (resultado) se recolectan en un momento determinado. El diseño es rápido y barato porque todas las medidas se realizan al mismo tiempo. El inconveniente es que el diseño no permite concluir sobre la causalidad, es decir, si el determinante precede al resultado, podría ser al revés o causado por otro factor (carente del criterio de Hill para la temporalidad de causalidad, Recuadro 1). Por lo tanto, este diseño de estudio es principalmente generador de hipótesis.
2.1.2 Estudio de casos y controles
En un estudio de casos y controles, la muestra se selecciona con base en el resultado, mientras que el determinante se mide en el pasado. En contraste con un estudio transversal, este diseño puede incluir mediciones en varios momentos, de ahí que se trate de un estudio longitudinal. Primero, se recluta a personas con la enfermedad (casos) y luego se involucran en el estudio controles emparejados (personas no afectadas por la enfermedad), comparables en lo que respecta a por ejemplo, edad, sexo y región geográfica. Es importante que los controles tengan el mismo riesgo de desarrollar la enfermedad que los casos. El determinante se recoge retrospectivamente, lo que significa que se pregunta a los participantes sobre la exposición en el pasado.
El carácter retrospectivo del diseño plantea un riesgo de sesgo de recuerdo cuando se pregunta a las personas sobre eventos que sucedieron en el pasado, es posible que no los recuerden correctamente. El sesgo de recuperación es una forma de sesgo de información, cuando un error de medición resulta en una clasificación errónea. El sesgo se define como una desviación sistemática de resultados o inferencias de la verdad (International Epidemiological Association, 2014). Se debe tener cuidado para sacar conclusiones sobre la causalidad con el diseño del estudio de casos y controles. De acuerdo con el criterio de temporalidad de Hill (ver Recuadro 1), la exposición precede al resultado, pero debido a que la exposición se recolecta retrospectivamente, la evidencia puede ser demasiado débil para sacar conclusiones sobre una relación causal. Los beneficios son que el diseño es adecuado para la investigación de enfermedades de baja incidencia (en un estudio prospectivo de cohorte resultaría en un número bajo de casos), y para la investigación de enfermedades con un largo periodo de latencia, es decir el tiempo que la exposición al determinante puede resultar en la enfermedad (en un estudio de cohorte prospectivo, tomaría muchos años hacer un seguimiento de los participantes hasta que se desarrolle la enfermedad).
Un ejemplo de estudio de casos y controles en epidemiología ambiental
Hoffman et al. (2017) investigaron el cáncer papilar de tiroides (PTC) y la exposición a productos químicos retardantes de llama (FR) en el ambiente interior. Las FR son productos químicos que se agregan a los productos domésticos para limitar la propagación del fuego, pero pueden lixiviarse al polvo de la casa donde los residentes pueden estar expuestos al polvo doméstico contaminado. Las FRs están asociadas con enfermedad tiroidea y cáncer de tiroides. En este estudio de casos y controles, se reclutaron casos PTC y casos emparejados (desenlace), y se evaluó la exposición a FR (determinante) midiendo FR en el polvo doméstico de los participantes. El estudio mostró que los participantes con mayor exposición a FR (concentraciones de bromodifenil éter-209 por encima del nivel medio) tuvieron 2.3 probabilidades más (ver sección Cuantificación de enfermedades y asociaciones) de tener PTC, en comparación con los participantes con menor exposición a FR (bromodifenil éter- 209 concentraciones por debajo del nivel medio).
2.1.3 Estudio de cohorte
Un estudio de cohorte, otro tipo de estudio longitudinal, incluye un grupo de individuos que son seguidos a lo largo del tiempo en el futuro (prospectivo) o a los que se les preguntará sobre el pasado (retrospectivo). En un estudio prospectivo de cohortes, el determinante se mide al inicio del estudio y se calcula la incidencia de la enfermedad después de cierto periodo de tiempo, el seguimiento. El diseño del estudio debe comenzar con personas que están en riesgo de padecer la enfermedad, pero que aún no están afectadas por la enfermedad. Por lo tanto, el diseño del estudio prospectivo permite concluir que puede haber una relación causal, ya que el resultado de salud sigue el determinante en el tiempo (temporalidad del criterio de Hill). No obstante, aún es posible la interferencia de otros factores, véase el párrafo 3 sobre confusión y modificación de efectos. Es posible observar más de 1 resultado de salud, pero el diseño es menos adecuado para enfermedades con baja incidencia o con un largo periodo de latencia, ya que entonces necesitas una gran población de estudio para tener suficientes casos, o necesitas seguir a los participantes durante mucho tiempo para casos de medida. Un problema importante con este diseño de estudio es el desgaste (pérdida de seguimiento), lo que significa hasta qué punto los participantes abandonan durante el curso de estudio. El sesgo de selección puede ocurrir cuando un cierto tipo de participantes abandona con mayor frecuencia, y la investigación se realiza con una selección de la población objetivo. El sesgo de selección también puede ocurrir al inicio de un estudio, cuando algunos miembros de la población objetivo tienen menos probabilidades de ser incluidos en la población de estudio en comparación con otros miembros y, por lo tanto, la muestra no es representativa de la población objetivo.
Un ejemplo de un estudio de cohorte prospectivo
De Cock et al. (2016) presentan un estudio de cohorte prospectivo que investiga la exposición temprana de la vida a los productos químicos y los efectos en la salud en la vida posterior, los EDC Linking en Nutrición Materna con Salud Infantil (estudio LINC Para ello, durante el embarazo se reclutaron más de 300 mujeres embarazadas. La exposición prenatal a sustancias químicas se midió en, entre otros, la sangre del cordón umbilical y la leche materna y los niños fueron seguidos a lo largo del tiempo, midiendo, entre otros, la estatura y el estado de peso. Por ejemplo, se evaluó la exposición prenatal a diclorodifenil-dicloroetileno (DDE), un metabolito del pesticida diclorodifenil-tricloroetano (DDT), midiendo DDE en sangre del cordón umbilical, recolectada al momento del parto. Durante el primer año se monitoreó el índice de masa corporal (IMC), basado en peso y talla. Los niveles de DDE en sangre de cordón umbilical se dividieron en 4 grupos iguales, llamados cuartiles. Los niños con las concentraciones más bajas de DDE (el primer cuartil) tuvieron una curva de crecimiento de IMC mayor en el primer año, en comparación con los niños con las concentraciones más altas de DDE (el cuarto cuartil) (De Cock et al., 2016).
2.1.4 Estudio anidado de casos y controles
Cuando se realiza un estudio de casos y controles dentro de un estudio de cohorte, se denomina estudio anidado de casos y controles. Se seleccionan los casos en un estudio de cohorte y se seleccionan los no casos coincidentes como controles. Este tipo de diseño de estudio es útil en caso de una baja cantidad de casos en un estudio de cohorte prospectivo.
Un ejemplo de un estudio anidado de casos y controles
Engel et al. (2018) investigaron el trastorno por déficit de atención e hiperactividad (TDAH) en niños en relación con la exposición prenatal al ftalato. Los ftalatos se agregan a diversos productos de consumo para ablandar los plásticos. La exposición ocurre durante la ingestión, inhalación o absorción dérmica y las fuentes son por ejemplo envases de plástico de alimentos, productos domésticos volátiles y productos de cuidado personal (Benjamin et al., 2017). Engel et al. (2018) llevaron a cabo un estudio anidado de casos y controles dentro de la Cohorte Norwegian Mother and Child (MoBA). La cohorte incluyó 112,762 pares madre-hijo de los cuales sólo una pequeña cantidad de casos con diagnóstico clínico de TDAH. Un total de 297 casos fueron muestreados aleatoriamente de registros de diagnósticos clínicos de TDAH. Además, 553 controles sin TDAH fueron muestreados aleatoriamente de la cohorte. Los metabolitos de ftalatos se midieron en la orina materna recolectada a la mitad del embarazo y las concentraciones se dividieron en 5 grupos iguales, llamados quintiles. Los hijos de madres en el quintil más alto de la suma de metabolitos del ftalato bis (2-etilhexil) ftalato (DEHP) tuvieron 2.99 (IC 95%: 1.47-5.49) más probabilidades (ver capítulo Cuantificación de enfermedades y asociaciones) de un diagnóstico de TDAH en comparación con el quintil más bajo.
2.2 Estudios experimentales
2.2.1 Ensayos controlados (no) aleatorios
Un ensayo controlado aleatorizado (ECA) es un estudio experimental en el que los participantes son asignados aleatoriamente a un grupo de intervención o a un grupo de control. El grupo de intervención recibe una intervención o tratamiento, el grupo control no recibe nada, cuidados habituales o un placebo. Los ensayos clínicos que prueban la efectividad de la medicación son un ejemplo de un ECA. Si la asignación de participantes a grupos no es aleatorizada, el diseño se denomina ensayo controlado no aleatorizado. Este último diseño proporciona menos fuerza de evidencia.
Cuando grupos de personas en lugar de individuos, son aleatorizados, el diseño del estudio se denomina ensayo controlado aleatorizado por grupos. Este es, por ejemplo, el caso cuando las aulas con niños en la escuela se asignan aleatoriamente al grupo de intervención- y control. Las variaciones se utilizan para cambiar grupos entre el grupo de intervención y el grupo de control. Por ejemplo, un diseño cruzado permite que las personas sean a la vez grupo de intervención y grupo control en diferentes fases del estudio. Para no limitar los beneficios de la intervención al grupo control, un diseño de lista de espera pone la intervención a disposición del grupo control después del periodo de investigación.
Un ejemplo de un estudio experimental
Un ejemplo de diseño de estudio experimental dentro de la investigación ambiental es el estudio de Bae y Hong (2015). En un ensayo cruzado aleatorio, los participantes tuvieron que tomar bebidas de una lata que contenía BPA o de una botella de vidrio sin BPA. Además de los niveles de BPA en orina, la presión arterial se midió después de la exposición. El diseño cruzado incluyó 3 períodos, ya sea bebiendo solo bebidas enlatadas, tanto bebidas enlatadas como embotelladas con vidrio o solo bebidas embotelladas con vidrio. La concentración de BPA se incrementó con 1600% después de tomar bebidas enlatadas en comparación con beber de botellas de vidrio.
3. Confusión y modificación de efectos
La confusión ocurre cuando un tercer factor influye tanto en el resultado como en el determinante (ver Figura 3). Por ejemplo, el número de cigarrillos fumados se asocia positivamente con la prevalencia de cáncer de esófago. Sin embargo, el número de cigarrillos fumados también se asocia positivamente con la cantidad de consumo estándar de alcohol en vasos. Además, el consumo de alcohol es un factor de riesgo para el cáncer esofágico. El consumo de alcohol es por lo tanto un confuso en la relación tabaquismo y cáncer de esófago. Se pueden corregir los factores de confusión en el análisis estadístico, por ejemplo, mediante estratificación (los resultados se presentan para los diferentes grupos por separado).
La modificación del efecto ocurre cuando la asociación entre la exposición/determinante y el resultado es diferente para ciertos grupos (Figura 3). Por ejemplo, el riesgo de cáncer de pulmón debido a la exposición al asbesto es aproximadamente diez veces mayor para los fumadores que para los no fumadores. Una solución para hacer frente a la modificación de efectos es también la estratificación.
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Casilla 1: Criterios de causalidad de Hill Con estudios epidemiológicos muchas veces no es posible determinar una relación causal. Es por ello que los estudios epidemiológicos suelen emplear un conjunto de criterios, los criterios de causalidad de Hill, según Sir Austin Bradford Hill, que deben considerarse antes de que se justifiquen las conclusiones sobre la causalidad (Hill, 1965).
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Referencias
Bae, S., Hong, Y.C. (2015). La exposición al bisfenol a por el consumo de bebidas enlatadas aumenta la presión arterial: Ensayo cruzado aleatorio. Hipertensión 65, 313-319. https://doi.org/10.1161/HYPERTENSIONAHA.114.04261
Benjamin, S., Masai, E., Kamimura, N., Takahashi, K., Anderson, R.C., Faisal, P.A. (2017). Los ftalatos impactan la salud humana: Evidencias epidemiológicas y mecanismo plausible de acción. J ournal de Materiales Peligrosos 340, 360-383. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2017.06.036
De Cock, M., De Boer, M.R., Lamoree, M., Legler, J., Van De Bor, M. (2016). Exposición prenatal a sustancias químicas disruptoras endocrinas y peso al nacer: estudio prospectivo de cohorte. Revista de Ciencias Ambientales y Salud - Parte A Sustancias Tóxicas/Peligrosas e Ingeniería Ambiental 51, 178-185. https://doi.org/10.1080/10934529.2015.1087753
De Cock, M., Quaak, I., Sugeng, E.J., Legler, J., Van De Bor, M. (2016). Vinculación de las EDC en la Nutrición Materna con la Salud Infantil (estudio LINC) - Protocolo de cohorte prospectivo para estudiar la exposición temprana de la vida a químicos ambientales y salud infantil. BMC Salud Pública 16:147. https://doi.org/10.1186/s12889-016-2820-8
Engel, S.M., Villanger, G.D., Nethery, R.C., Thomsen, C., Sakhi, A.K., Drover, S.S.M.,... Aase, H. (2018). Ftalatos prenatales, función tiroidea materna y riesgo de trastorno por déficit de atención e hiperactividad en la cohorte madre e hijo noruega. Perspectivas de salud ambiental. https://doi.org/10.1289/EHP2358
Cerro, A.B. (1965). El medio ambiente y la enfermedad: ¿asociación o causalidad? Revista de la Real Sociedad de Medicina 58, 295-300. https://doi.org/10.1177/003591576505800503
Hoffman, K., Lorenzo, A., Butt, C.M., Hammel, S.C., Henderson, B.B., Roman, S.A.,... Sosa, J.A. (2017). Exposición a químicos retardantes de llama y ocurrencia y gravedad del cáncer papilar de tiroides: Un estudio de casos y controles. Medio Ambiente Internacional 107, 235-242. https://doi.org/10.1016/j.envint.2017.06.021
Asociación Internacional Epidemiológica. (2014). Diccionario de epidemiología. Prensa de la Universidad de Oxford. https://doi.org/10.1093/ije/15.2.277
Por último, J.M. (2001). Un Diccionario de Epidemiología. 4ª edición, Oxford, Oxford University Press.
El investigador A investiga la relación entre los parabenos y el cáncer de mama. Ella incluye 200 mujeres con cáncer de mama y 200 mujeres sin cáncer y pregunta a todas las mujeres sobre el uso de productos de cuidado personal que contienen parabenos en los últimos 10 años usando un cuestionario. ¿Cuál es el diseño del estudio que se utiliza?
Estudio de casos y controles
Estudio transversal
Estudio prospectivo de cohortes
Ensayo controlado aleatorizado
El investigador B tiene una opinión sobre las ventajas y desventajas del diseño del estudio que se eligió. ¿Cuál de las siguientes ventajas de este diseño es correcta?
Hay una baja probabilidad de sesgo recall-bias.
El diseño es capaz de demostrar una relación causal entre la exposición y el resultado.
El diseño toma en cuenta el largo periodo de latencia para el cáncer de mama.
El Riesgo Relativo (RR) puede ser utilizado en este diseño.
El investigador B participa en un estudio prospectivo de cohortes que investiga la exposición al plomo y el TDAH en niños. Exposición prenatal al plomo medida en sangre del cordón umbilical, recolectada al momento del parto. A los 7 años se contabilizaron los síntomas de TDAH. Encontraron que mayores concentraciones de plomo se asociaron con más síntomas de TDAH tanto en niños como en niñas. Los niños presentaron más síntomas de TDAH que las niñas y mayores niveles de plomo. ¿Qué tipo de factor es el género?
Determinante
Confundadora
Modificador de efectos
Resultado
4.3.10. Epidemiología ambiental - II. Cuantificación de enfermedades y asociaciones
Autores: Eva Sugeng y Lily Fredrix
Revisores: Ãubica Murínová y Raymond Niesink
Objetivos de aprendizaje
Deberías ser capaz de
- describir las medidas de la enfermedad.
- calcular e interpretar los tamaños de los efectos que se ajusten al diseño del estudio epidemiológico.
- describir e interpretar el nivel de significancia.
- describir la estratificación e interpretar datos estratificados.
1. Medidas de la enfermedad
La prevalencia es la proporción de una población con un desenlace en un momento determinado (por ejemplo, actualmente 40% de la población está afectada por la enfermedad Y) y puede calcularse en estudios transversales.
La incidencia se refiere solo a nuevos casos, y la incidencia acumulada es la proporción de nuevos casos en la población a lo largo de un cierto lapso de tiempo (por ejemplo, 60% nuevos casos de influenza por año). La incidencia (acumulativa) solo se puede calcular en diseños de estudios prospectivos, debido a que la población necesita estar en riesgo para desarrollar la enfermedad y por lo tanto los participantes no deben verse afectados por la enfermedad al inicio del estudio.
El Riesgo Atribuible Poblacional (PAR) es una medida para expresar el incremento de la enfermedad en una población debido a la exposición. Se calcula con esta fórmula:
2. Tamaños de efecto
2.1 En caso de resultados dicotómicos (enfermedad, sí versus no)
La razón de riesgo o riesgo relativo (RR) es la relación entre la incidencia en el grupo expuesto y la incidencia en el grupo no expuesto (Cuadro 1):
El RR solo puede ser utilizado en diseños prospectivos, ya que consiste en probabilidades de un desenlace en una población en riesgo. El RR es 1 si no hay riesgo ,1 <1 if there is a decreased risk, and > si hay un mayor riesgo. Por ejemplo, los investigadores encuentran un RR de 0.8 en un hipotético estudio prospectivo de cohortes sobre la región en la que viven los niños (rural vs. urbano) y el desarrollo del asma (desenlace). Esto significa que los niños que viven en zonas rurales tienen un riesgo 0.8 menor de desarrollar asma, en comparación con los niños que viven en las zonas urbanas.
La diferencia de riesgo (RD) es la diferencia entre los riesgos en dos grupos (Tabla 1):
Odds ratio (OR) es la relación entre las probabilidades sobre el resultado en el grupo expuesto y las probabilidades del resultado en el grupo no expuesto (Cuadro 1).
El OR se puede utilizar en cualquier diseño de estudio, pero se usa con mayor frecuencia en estudios de casos y controles. (Cuadro 1) El OR es 1 si no hay diferencia en las cuotas, >1 si hay cuotas más altas, y <1 si hay cuotas más bajas. Por ejemplo, los investigadores encuentran un OR de 2.5 en un hipotético estudio de casos y controles sobre el cáncer de mesotelioma y la exposición ocupacional al asbesto en el pasado. Los pacientes con cáncer de mesotelioma tuvieron 2.5 mayores probabilidades de ser ocupacionales expuestos al asbesto en el pasado en comparación con los controles sanos.
El OR también se puede utilizar en términos de probabilidades sobre la enfermedad en lugar de la exposición, las fórmulas son entonces (Tabla 1):
Por ejemplo, los investigadores encuentran una razón de probabilidades de 0.9 en un estudio transversal que investiga el cáncer de mesotelioma en constructores que trabajan con asbesto comparando el uso de ropa protectora y máscaras. Los constructores que usaban ropa protectora y máscaras tenían 0.9 probabilidades de tener cáncer de mesotelioma en comparación con constructores que no usaban ropa y máscaras protectoras.
Tabla 1: tabla conceptual a utilizar para el cálculo del RR, RD y OR
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Enfermedad/resultado + |
Enfermedad/resultado - |
|
|
Exposo/Determinante + |
A |
B |
|
Exposo/determinante - |
C |
D |
2.2 En caso de resultados continuos (cuando hay una escala en la que se puede medir una enfermedad, por ejemplo, la presión arterial)
La diferencia media es la diferencia entre la media en el grupo expuesto versus el grupo no expuesto. Esto también es aplicable a diseños experimentales con seguimiento para evaluar el aumento o disminución del resultado después de una intervención: la media al inicio versus la media después de la intervención. Esto se puede estandarizar usando las siguientes fórmulas:
La desviación estándar (DE) es una medida de la dispersión de un conjunto de valores. En la práctica, la DE debe estimarse ya sea a partir de la DE del grupo control, o a partir de un valor 'global' de ambos grupos. El índice más conocido para el tamaño del efecto es Cohens 'd'. La diferencia de medias estandarizadas puede tener tanto un valor negativo como un positivo (entre -2.0 y +2.0). Con un valor positivo, se muestra el efecto beneficioso de la intervención, con un valor negativo, el efecto es contraproducente. En general, un tamaño de efecto de por ejemplo 0.8 significa un efecto grande.
3. Significancia estadística e intervalo de confianza
Las mediciones del efecto como el riesgo relativo, la razón de probabilidades y la diferencia media se reportan junto con significancia estadística y/o un intervalo de confianza. La significancia estadística se utiliza para retener o rechazar hipótesis nulas. El estudio comienza con una hipótesis nula, suponemos que no hay diferencia entre variables o grupos, por ejemplo RR=1 o la diferencia en medias es 0. Entonces la prueba estadística nos da la probabilidad de obtener el resultado observado (e.g. OR=2.3, o diferencia media=1.5) cuando de hecho la hipótesis nula es verdadera. Si la probabilidad es menor al 5%, concluimos que la observación es verdadera y podemos rechazar la hipótesis nula. La probabilidad del 5% corresponde a un valor p de 0.05. Generalmente se usa un valor de corte p de p<0.05, lo que significa que los valores p menores a 0.05 se consideran estadísticamente significativos.
El intervalo de confianza del 95%. Un intervalo de confianza del 95% es un rango de valores dentro del cual se puede estar 95% seguro de que se encuentra la verdadera media de la población o medida de asociación. Por ejemplo, en el hipotético estudio transversal sobre tabaquismo (sí o no) y cáncer de pulmón, se encontró una OR de 2.5, con un IC 95% de 1.1 a 3.5. Eso quiere decir, podemos decir con 95% de certeza que el verdadero OR se encuentra entre 1.1 y 3.5. Esto se considera estadísticamente significativo, ya que el 1, lo que significa que no hay diferencia en las probabilidades, no se encuentra dentro del IC 95%. Si los investigadores también estudiaron el cáncer de esófago en relación al tabaquismo y encontraron un OR de 1.9 con IC 95% de 0.6-2.6, esto no se considera estadísticamente significativo, ya que el IC 95% incluye 1.
4. Estratificación
Cuando dos poblaciones investigadas tienen una distribución diferente de, por ejemplo, edad y género, a menudo es difícil comparar las frecuencias de enfermedades entre ellas. Una forma de lidiar con esto es analizar las asociaciones entre la exposición y el resultado dentro de los estratos (grupos). A esto se le llama estratificación. Ejemplo: un estudio hipotético para investigar diferencias en salud (resultado, medido con número de síntomas, como dificultad para respirar al caminar) entre dos grupos de adultos mayores, ancianos urbanos (n=682) y ancianos rurales (n=143) (determinante). No se encontró diferencia entre adultos mayores urbanos y rurales, sin embargo hubo una diferencia en el número de mujeres y hombres en ambos grupos. Por lo tanto, los resultados de síntomas para adultos mayores urbanos y rurales se estratifican por género (Cuadro 2). Entonces, al parecer, el adulto mayor urbano masculino presenta más síntomas que el adulto mayor rural masculino (p=0.01). La diferencia no es significativa para las mujeres (p=0.07). Las diferencias en la salud de los adultos mayores que viven en una región urbana son diferentes para hombres y mujeres, de ahí que el género sea un modificador del efecto de nuestra asociación de interés.
Cuadro 2. Número de síntomas (expresado como porcentaje) para adultos mayores urbanos y rurales estratificados por género. Diferencias significativas en negrita.
|
número de síntomas |
Mujeres |
Hombres |
||
|
Urbano |
Rural |
Urbano |
Rural |
|
|
Ninguno |
16.0 |
30.4 |
16.2 |
43.5 |
|
Uno |
26.4 |
30.4 |
45.2 |
47.8 |
|
Dos o más |
57.6 |
39.1 |
37.8 |
8.7 |
|
N |
125 |
23 |
74 |
23 |
|
valor p |
0.07 |
0.01 |
||
El investigador B investiga la relación entre los parabenos y el cáncer de mama mediante un diseño transversal. Ella incluye a 500 mujeres entre 55-65 años y les pregunta sobre el uso de productos de cuidado personal que contienen parabenos mediante un cuestionario, que divide al grupo en usuarios frecuentes (N=267) y usuarios poco frecuentes (N=233). Además pregunta si las mujeres tienen un diagnóstico de cáncer de mama y descubre que 41 mujeres tienen cáncer de mama, de estas mujeres, 30 usan frecuentemente PCP. ¿Cuál es el resultado correcto de este estudio?
El Odds Ratio es 3.6.
El Riesgo Atribuible Poblacional es de 0.4.
La incidencia de cáncer de mama en esta población es de 8.2%
La prevalencia de cáncer de mama en esta población es de 8.2%.
Con el análisis estadístico para obtener el OR, el Investigador A encuentra los siguientes números: OR=2.6, 95CI: 0.9-3.5, p=0.07. ¿Cuál es la interpretación?
Los usuarios frecuentes de PCP tienen probabilidades significativamente mayores de tener cáncer de mama.
Los usuarios frecuentes de PCP tienen mayores probabilidades de cáncer de mama, pero no significativamente.
Los usuarios frecuentes de PCP tienen mayor riesgo de cáncer de mama, pero no significativamente
Los usuarios frecuentes de PCP tienen un riesgo significativamente mayor de cáncer de mama
Investigadores investigan una intervención para reducir la exposición a ftalatos. El grupo de intervención recibe asesoría para reducir ftalatos en alimentos, productos de cuidado personal y productos domésticos volátiles. El grupo de control no obtiene la intervención. Antes y después del período de intervención, se recolectan muestras de orina de los participantes y se analizan para detectar metabolitos de ftalatos. ¿Qué es incorrecto?
Los investigadores pueden concluir sobre la causalidad, porque la exposición procede del resultado.
Los investigadores pueden cuantificar el tamaño de la diferencia entre el grupo de intervención y control mediante estratificación.
Los investigadores pueden mostrar si la intervención reduce (o aumenta) la exposición con una diferencia de riesgo.
Que no haya diferencia entre el grupo de intervención y control se denomina hipótesis nula.
4.3.11. Epidemiología molecular - I. Biomonitorización humana
Autor: Marja Lamoree
Revisores: Michelle Plusquin y Adrian Covaci
Objetivos de aprendizaje:
Deberías ser capaz de
- explicar el propósito de la biomonitorización humana
- entender que la dosis interna puede provenir de diferentes vías de exposición
- describir los diferentes pasos en los métodos analíticos y aclarar los requisitos específicos con respecto al muestreo, almacenamiento, sensibilidad, rendimiento y precisión
- aclarar el papel del metabolismo en la distribución de muestras en el cuerpo humano y especificar algunas matrices de muestra
- explicar el papel de la ética en los estudios de biomonitorización humana
Palabras clave: análisis químico, muestras humanas, exposición, ética, cohorte
Biomonitorización humana
El biomonitoreo humano (HBM) implica la evaluación de la exposición humana a productos químicos naturales y sintéticos mediante el análisis cuantitativo de estos compuestos, sus metabolitos o productos de reacción en muestras de origen humano. Las muestras utilizadas en HBM pueden incluir sangre, orina, rostros, saliva, leche materna y sudor u otros tejidos, como el cabello, las uñas y los dientes.
Las concentraciones determinadas en muestras humanas son un reflejo de la exposición de un individuo a los compuestos analizados, también referidos como la dosis interna. Los datos de HBM se recopilan para obtener información sobre la exposición de la población a los productos químicos, a menudo con el objetivo de integrarlos con datos de salud para la evaluación del impacto en la salud en estudios epidemiológicos. A menudo, se atienden grupos de edad específicos, como neonatos, niños pequeños, niños, adolescentes, adultos y ancianos. El biomonitoreo humano es un método establecido en la evaluación de la exposición ocupacional y ambiental.
En varios países, los estudios de HBM se llevan a cabo desde hace décadas, como el programa GerES (GerES) y el programa National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES) en Estados Unidos. Los programas de HBM a veces se pueden llevar a cabo bajo el paraguas de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Otros ejemplos son la Encuesta Canadiense de Medidas de Salud, el Estudio Flamenco de Medio Ambiente y Salud y el Estudio del Medio Ambiente y los Niños de Japón, este último se centra específicamente en los niños pequeños. Se considera que los niños tienen un mayor riesgo de sufrir los efectos adversos para la salud de la exposición temprana a contaminantes químicos, debido a su rápido crecimiento y desarrollo y su limitada capacidad metabólica para desintoxicar productos químicos nocivos.
Cuadro 1. Fuentes de información para programas de Biomonitorización Humana (HBM)
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Programa |
Enlace a Internet |
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Encuesta Alemana de Medio Ambiente (GERes) |
www.umweltbundesamt.de/es/temas/salud/evaluación-riesgos-salud-relacionadoscon el medioambiental/encuesta-ambiental-alemana-geres |
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Encuesta Nacional de Examen de Salud y Nutrición (NHANES) |
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QUIEN |
www.euro.who.int/es/data-and-evidence/sistema-de-informacion-ambiente-y-salud-eshis/actividades/encuesta de biomonitorización humana |
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Encuesta Canadiense de Medidas de Salud (CHMS) |
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Japón Medio Ambiente y Estudio Infantil (JECS) |
Los estudios enfocados en el impacto de la exposición a químicos en la salud se realizan con el uso de cohortes: grupos de personas que se inscriben en un determinado estudio y se ofrecen como voluntarios para participar en el programa de investigación. Por lo general, además de donar por ejemplo muestras de sangre u orina, se recogen medidas de salud, como presión arterial, peso corporal, niveles hormonales, etc. pero también se recogen datos sobre dieta, educación, antecedentes sociales, situación económica y estilo de vida, estos últimos mediante el uso de cuestionarios. Un estudio transversal tiene como objetivo la adquisición de datos de exposición y salud de todo el grupo (voluntario) en un momento definido, mientras que en un estudio longitudinal se realizan estudios de seguimiento con cierta frecuencia (es decir, cada pocos años) para seguir y evaluar los cambios en la exposición, describir el tiempo tendencias así como estudiar la salud y el estilo de vida a largo plazo (ver sección sobre Epidemiología Ambiental). Para obtener suficiente poder estadístico para derivar relaciones significativas entre la exposición y los eventuales efectos (sobre la salud), el número de participantes en los estudios de HBM suele ser muy grande, es decir, que va a 100 mil participantes.
Debido a que se recopilan muchos datos (a veces sensibles) de muchos individuos, la ética es un aspecto importante de cualquier estudio de HBM. Antes de iniciar un determinado estudio que involucre a HBM, un Comité de Aprobación Ética Médica necesita aprobarlo. Las solicitudes para obtener la aprobación requieren documentación integral de i) el protocolo de estudio (lo que se está investigando exactamente), ii) una declaración sobre la salvaguardia de la privacidad y los datos recopilados de las personas físicas, el acceso de los investigadores a los datos y el almacenamiento seguro de toda la información y iii ) una carta informativa para los voluntarios en la que se explique el objetivo y los procedimientos utilizados en el estudio y sus derechos (por ejemplo, retirarse), para que puedan dar su consentimiento para ser incluidos en el estudio.
Absorción, distribución, metabolismo y excreción química
Debido a que los productos químicos a menudo experimentan transformación metabólica (ver sección Metabolismo y defensa xenobióticos) después de ingresar al cuerpo por ingestión, absorción dérmica e inhalación, es importante no solo enfocarse en el compuesto parental (= el compuesto al que estuvo expuesto el individuo), sino también incluyen metabolitos. La dieta, el estado socioeconómico, la ocupación, el estilo de vida y el medio ambiente contribuyen a la exposición de los humanos, mientras que la edad, el género, el estado de salud y el peso de un individuo definen el efecto de la exposición. Los datos de HBM proporcionan una agregación de todas las diferentes rutas a través de las cuales se expuso el individuo. Sin embargo, para una investigación en profundidad de las fuentes de exposición, siguen siendo necesarios análisis químicos de, por ejemplo, la dieta (incluida el agua potable), el ambiente interior y exterior. Otra fuente importante de químicos a los que las personas están expuestas en su día a día son los productos de consumo, como la electrónica, muebles, textiles, etc., que pueden contener retardantes de llama, repelentes de manchas, colorantes y colorantes, conservantes, entre otros.
La distribución de un químico en el cuerpo es altamente dependiente de sus propiedades fisicoquímicas, como la lipofilicidad/hidrofilicidad y persistencia, mientras que también la transformación de fase I y Fase II (ver sección Metabolismo y defensa xenobióticos) juegan un papel determinante, ver Figura 1. Para los compuestos lipófilos (por ejemplo, la sección sobre COP) el almacenamiento ocurre en el tejido adiposo, mientras que los compuestos moderadamente lipófilos a hidrófilos se excretan después de la transformación metabólica, o en forma inalterada. En base a estas consideraciones, se puede hacer una elección adecuada para el muestreo de la matriz apropiada, es decir, algunos químicos se miden mejor en la orina, mientras que para otros la sangre puede ser mejor adecuada.
Para el diseño de la campaña de muestreo se deben tomar en cuenta las propiedades de los compuestos a analizar. En caso de volatilidad, se deben utilizar recipientes herméticos de muestreo, mientras que para los compuestos sensibles a la luz, la cristalería de color ámbar es la opción óptima.
Idealmente, después de la recolección, las muestras deben almacenarse en las condiciones correctas lo más rápidamente posible, para evitar la degradación causada por la inestabilidad térmica o por la biodegradación causada por la actividad enzimática restante en la muestra (por ejemplo, en muestras de sangre o leche materna). El etiquetado y almacenamiento de las grandes cantidades de muestras generalmente incluidas en los estudios de HBM son partes importantes de la campaña de muestreo (ver para video: https://www.youtube.com/watch?v=FQjKKvAhhjM).
Análisis químico de muestras humanas para evaluación de exposición
Típicamente, para la determinación de las concentraciones de compuestos a los que están expuestas las personas y los metabolitos correspondientes formados en el cuerpo humano, se aplican técnicas analíticas como cromatografía líquida y de gases (LC y GC, respectivamente) acopladas a espectrometría de masas (MS). Se emplea cromatografía para la separación de los compuestos, mientras que la EM se usa para detectar los compuestos. Antes del análisis usando LC- o GC-MS, la muestra se pretrata (por ejemplo, se eliminan las partículas) y se extrae, es decir, los compuestos a analizar se concentran en un pequeño volumen mientras que los constituyentes de la matriz de la muestra que pueden interferir con el análisis (por ejemplo, lípidos, proteínas) se eliminan, dando como resultado un extracto que está listo para ser inyectado en el sistema cromatográfico.
En la Figura 2 se da una representación esquemática de todos los pasos del procedimiento analítico.
Los métodos analíticos para cuantificar las concentraciones de sustancias químicas con el fin de evaluar la exposición humana deben ser de alta calidad debido a la naturaleza específica de los estudios de HBM. Los compuestos a analizar suelen estar presentes en concentraciones muy bajas (es decir, del orden de pg/L para la sangre del cordón umbilical), y los volúmenes de muestra son pequeños. Para algunas matrices, los pequeños volúmenes de muestra están dictados por el hecho de que la disponibilidad de la muestra no es ilimitada, por ejemplo, para la sangre. Otro factor que rige el volumen limitado de muestra disponible son los costos que están relacionados con el requisito de espacio de almacenamiento dedicado a largo plazo en condiciones de -20 ⁰C o incluso -80 ⁰C para garantizar la integridad y estabilidad de la muestra.
Los compuestos en los que a menudo se enfocan los estudios de HBM son aquellos a los que estamos expuestos en la vida diaria. Esto implica que el procedimiento analítico debe ser capaz de tratar la contaminación de la muestra con los compuestos a analizar, debido a la presencia de los compuestos en nuestro entorno. Una mayor contaminación de fondo conduce a una disminución de la capacidad de detectar concentraciones bajas, impactando así negativamente la calidad de los estudios. Ejemplos de compuestos que se han monitorizado frecuentemente en orina humana son los ftalatos, como el ftalato de dietil hexilo o en breve DEHP. El DEHP es un químico utilizado en muchos productos de consumo y, por lo tanto, la contaminación de las muestras con DEHP del entorno influye severamente en las mediciones analíticas. Una forma de evitar esto es enfocarse en los metabolitos del DEHP después del metabolismo de la Fase I o II: esto garantiza que el químico ha pasado por el cuerpo humano y ha sufrido una transformación metabólica, y su detección no se debe a la contaminación del fondo, lo que resulta en una métrica de exposición más confiable. Cuando se diseñe el método analítico para el análisis cuantitativo de metabolitos, se debe incluir un paso enzimático para la desconjugación de los metabolitos de Fase II (ver sección Metabolismo xenobiótico y defensa).
Debido a que los datos generados, es decir, las concentraciones de los compuestos en las muestras humanas, se utilizan para determinar parámetros como los niveles de exposición promedio/mediano, la frecuencia de detección de compuestos específicos y los niveles de exposición más altos/más bajos, la precisión de las mediciones debe ser alta. Además, los métodos analíticos utilizados para HBM deben ser capaces de alto rendimiento, es decir, el tiempo necesario por análisis debe ser bajo, debido a la gran cantidad de muestras que normalmente se analizan, del orden de cien a unos pocos miles de muestras, dependiendo del estudio.
Resumiendo, los datos de HBM apoyan la evaluación de tendencias temporales y patrones espaciales en la exposición humana, arrojan luz sobre subpoblaciones que están en riesgo y proporcionan información sobre la efectividad de las medidas para reducir o incluso prevenir los efectos adversos para la salud debido a la exposición química.
Información de antecedentes:
Información del proyecto HBM4EU: www.hbm4eu.eu; video: https://www.youtube.com/watch?v=DmC1v6EAeAM&feature=youtu.be.
Dibujar un esquema de un procedimiento analítico típico para la determinación cuantitativa de la concentración de un compuesto en una muestra determinada y nombrar los diferentes pasos.
¿Cuáles son los objetivos de la biomonitorización humana?
¿Por qué es útil enfocar el HBM en los metabolitos de los productos químicos y no en el químico original, que es el caso de, por ejemplo, los ftalatos?
Mencionar 5 factores relacionados con el análisis químico en HBM y explicar su importancia
La aprobación ética de un Comité de Aprobación Ética Médica es obligatoria para llevar a cabo un estudio de HBM. Especificar qué tipo de información se debe incluir en un expediente para obtener la aprobación.
4.3.11. Epidemiología molecular - II. El exposoma y los marcadores moleculares internos
(borrador)
Autores: Karen Vrijens y Michelle Plusquin
Revisores: Frank Van Belleghem,
Objetivos de aprendizaje
Deberías ser capaz de
- explicar el concepto del exposoma, incluyendo sus diferentes exposiciones
- comprender la aplicación del modelo meet-in-the-middle en estudios epidemiológicos moleculares
- describir cómo diferentes marcadores moleculares como la expresión génica, la epigenética y la metabolómica pueden representar sensibilidad a cierta exposición ambiental
Exposoma
La idea del exposoma fue descrita por Christopher Wild en 2005 como una medida de todas las exposiciones humanas de por vida, incluido el proceso de cómo estas exposiciones se relacionan con la salud. Un objetivo importante del exposoma es explicar cómo las exposiciones no genéticas contribuyen a la aparición o desarrollo de enfermedades crónicas importantes. Este concepto representa la totalidad de las exposiciones de tres amplios dominios, es decir, interno, externo específico y externo general (Figura 1) (Wild, 2012). El exposoma interno incluye procesos como metabolismo, hormonas circulantes endógenas, morfología corporal, actividad física, microbiota intestinal, inflamación y envejecimiento. Las exposiciones externas específicas incluyen diversos agentes, por ejemplo, radiación, infecciones, contaminantes químicos y contaminantes, dieta, factores de estilo de vida (por ejemplo, tabaco, alcohol) e intervenciones médicas. Las influencias sociales, económicas y psicológicas más amplias sobre el individuo conforman el exposoma externo general, incluyendo los siguientes factores pero no limitados a capital social, educación, situación financiera, estrés psicológico, entorno urbano-rural, clima, etc. 1.
El concepto de exposoma ilustra claramente la complejidad del entorno al que están expuestos los humanos en la actualidad, y cómo esto puede afectar la salud humana. Se necesitan biomarcadores internos de exposición (ver sección Biomonitorización humana) así como biomarcadores de efecto, para desenredar la compleja interacción entre varias exposiciones que ocurren potencialmente simultáneamente y a diferentes concentraciones a lo largo de la vida. Los avances en ciencias biomédicas y biología molecular recopilando así información holística de epigenética, transcriptoma (ver sección Expresión génica), metaboloma (ver sección Metabolómica), etc. están a la vanguardia para identificar biomarcadores de exposición así como de efecto.
Marcadores moleculares internos del exposoma
Conoce en el modelo medio
Para determinar el efecto sobre la salud de la exposición ambiental, los marcadores que puedan detectar cambios tempranos antes de que surja la enfermedad son esenciales y pueden implementarse en medicina preventiva. Estos tipos de marcadores pueden verse como biomarcadores intermedios de efecto, y su descubrimiento se basa en estudios a gran escala en diferentes niveles de biología (transcriptómica, genómica, metabolómica). El término “ómica” se refiere a la medición cuantitativa de conjuntos globales de moléculas en muestras biológicas utilizando técnicas de alto rendimiento (es decir, experimentos automatizados que permiten la repetición a gran escala) 7, en combinación con herramientas avanzadas de bioestadística y bioinformática 8. Dada la disponibilidad de datos de plataformas ómicas de alto rendimiento, junto con mediciones confiables de exposiciones externas, el uso de omics mejora la búsqueda de marcadores que juegan un papel en la vía biológica que vincula la exposición al riesgo de enfermedad.
Se sugirió el concepto de encuentro en el medio (MITM) como una forma de abordar el desafío de identificar las relaciones causales que vinculan las exposiciones y el resultado de la enfermedad (Figura 2). El primer paso de este enfoque consiste en la investigación de la asociación entre exposición y biomarcadores de exposición. El siguiente paso consiste en el estudio de la relación entre (biomarcadores de) exposición y biomarcadores ómicos intermedios de efectos tempranos; y tercero, se evalúa la relación entre el resultado de la enfermedad y los biomarcadores ómicos intermedios. El MITM estipula que la naturaleza causal de una asociación se refuerza si se encuentra en los tres pasos. Los marcadores moleculares que indican susceptibilidad a ciertas exposiciones ambientales están empezando a descubrirse y pueden ayudar en estrategias de prevención específicas. Por lo tanto, este enfoque depende en gran medida de nuevos desarrollos en epidemiología molecular, en los que la biología molecular se fusiona en estudios epidemiológicos. A continuación, se discuten en detalle los diferentes niveles de biología molecular actualmente estudiados para identificar marcadores de exposición y efecto.
Niveles
Los biomarcadores intermedios pueden identificarse como indicadores medibles de ciertos estados biológicos en diferentes niveles de la maquinaria celular, y varían en su tiempo de respuesta, duración, sitio y mecanismo de acción. Se pueden preferir diferentes marcadores moleculares dependiendo de la (s) exposición (es) bajo estudio.
Expresión génica
Los cambios a nivel de ARNm pueden estudiarse siguiendo un enfoque candidato en el que los ARNm con un papel biológico sospechoso de estar involucrados en la respuesta molecular a cierto tipo de exposición (por ejemplo, ARNm inflamatorios en el caso de exposición al humo del tabaco) se seleccionan a priori y se miden usando tecnología de PCR cuantitativa o alternativamente a nivel de todo el genoma mediante análisis de micromatrices o tecnología de secuenciación de próxima generación. 10 Los cambios a nivel transcriptoma, se estudian analizando la totalidad de las moléculas de ARN presentes en un tipo celular o muestra.
Ambos tipos de estudios han demostrado su utilidad en epidemiología molecular. Hace aproximadamente una década se publicó el primer estudio informando sobre perfiles de expresión génica candidatos que se asociaron con la exposición a diversos carcinógenos 11. Casi al mismo tiempo, se publicaron los primeros estudios sobre transcriptómica, incluyendo perfiles transcriptómicos para una población expuesta a dioxinas 12, en asociación con la exposición a diesel-escape, 13 y comparando fumadores versus no fumadores tanto en sangre 14 como vía aérea células epiteliales 15. Más recientemente, la atención se ha centrado en las exposiciones prenatales en asociación con firmas transcriptómicas, ya que esto encaja dentro del alcance del concepto de exposoma. Como tal, se han descrito perfiles transcriptómicos en asociación con la exposición al tabaquismo materno evaluada en tejido placentario, 16 así como la exposición a materia particulada en muestras de sangre del cordón umbilical 17.
Epigenética
La epigenética se relaciona con todos los cambios heredables en que no afectan directamente a la secuencia de ADN en sí. El mecanismo epigenético más estudiado en el campo de la epidemiología ambiental hasta la fecha es la metilación del ADN. La metilación del ADN se refiere al proceso en el que se agregan grupos metil a una secuencia de ADN. Como tal, estos cambios de metilación pueden alterar la expresión de un segmento de ADN sin alterar su secuencia. La metilación del ADN se puede estudiar mediante un enfoque de genes candidatos utilizando un diseño basado en la digestión o, más comúnmente utilizado, una conversión de bisulfito seguida de pirosecuenciación, PCR específica de metilación o una matriz de perlas. El tratamiento con bisulfito del ADN media la desaminación de citosina en uracilo, y estos residuos convertidos se leerán como timina, según lo determinado por amplificación por PCR y secuenciación. Sin embargo, 5 residuos mC son resistentes a esta conversión y permanecerán leídos como citosina (Figura 3).
Si es deseable un enfoque no dirigido, se pueden seguir varias estrategias para obtener datos de metilación del genoma completo, incluida la secuenciación. Las tecnologías de epigenotipado como la metilación humana BeadChips 18 generan un 'pseudo-SNP' específico del estado de metilación a través de la conversión de bisulfito; por lo tanto, traduciendo las diferencias en los patrones de metilación del ADN en diferencias de secuencia que pueden analizarse mediante genotipado cuantitativo métodos 19.
Una característica interesante de la metilación del ADN es que puede tener efectos transgeneracionales (es decir, efectos que actúan a través de múltiples generaciones). Esto se mostró por primera vez en un estudio sobre una población que estuvo prenatalmente expuesta a la hambruna durante el invierno holandés del hambre en 1944-1945. Estos individuos tuvieron menos metilación del ADN del gen impreso que codifica el factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF2) medido 6 décadas después en comparación con sus hermanos del mismo sexo no expuestos. La asociación fue específica para la exposición periconcepcional (es decir, la exposición durante el período anterior a la concepción hasta el embarazo temprano), reforzando que el desarrollo muy temprano de los mamíferos es un período crucial para establecer y mantener las marcas epigenéticas 20.
Las modificaciones postraduccionales (es decir, referidas a la modificación bioquímica de proteínas después de la biosíntesis de proteínas) recientemente ganaron más atención ya que se sabe que son inducidas por estrés oxidativo 21 (ver secciones sobre Estrés oxidativo) y mediadores inflamatorios específicos 22. Además de su función en la estructura de la cromatina en células eucariotas, se ha demostrado que las histonas tienen actividades tóxicas y proinflamatorias cuando se liberan en el espacio extracelular 23. Se ha prestado mucha atención a las asociaciones entre las exposiciones a metales y las modificaciones de histonas 24, aunque recientemente se publicó un primer estudio en humanos sobre la asociación entre la exposición a la materia particulada y la modificación de histonas H3 25.
Expresión de microARN (los miARN son ARN pequeños no codificantes de ~22 nt de longitud que están involucrados en la regulación de la expresión génica a nivel postranscripcional degradando sus ARNm diana y/o inhibiendo su traducción) {Ambros et al,2004} {Ambros, 2004 #324} {Ambros, 2004 #324} También se ha demostrado que sirven como un valioso marcador de exposición, tanto los enfoques candidatos como los no dirigidos han dado como resultado la identificación de patrones de expresión de miARN asociados con la exposición al tabaquismo 26, material particulado 27 y productos químicos como los bifenilos policlorados (PCB) 28 .
Metabolómica
La metabolómica se ha propuesto como un enfoque valioso para abordar los desafíos del exposoma. La metabolómica, el estudio del metabolismo a nivel de todo el cuerpo, implica la evaluación de todo el repertorio de productos metabólicos de moléculas pequeñas presentes en una muestra biológica. A diferencia de genes, transcritos y proteínas, los metabolitos no están codificados en el genoma. También son químicamente diversos, consistentes en carbohidratos, aminoácidos, lípidos, nucleótidos y más. Se espera que los humanos contengan algunos miles de metabolitos, incluidos los que ellos mismos elaboran, así como nutrientes y contaminantes de su ambiente y sustancias producidas por los microbios en el intestino. El estudio de la metabolómica aumenta el conocimiento sobre las interacciones entre la expresión génica y proteica, y el ambiente 29. La metabolómica puede ser un biomarcador del efecto de la exposición ambiental ya que permite la caracterización completa de los cambios bioquímicos que ocurren durante el metabolismo xenobiótico (ver Sección Metabolismo y defensa xenobióticos). Los desarrollos tecnológicos recientes han permitido reducir el volumen de muestra necesario para el análisis del metaboloma completo, permitiendo evaluar los cambios metabólicos en todo el sistema que ocurren como resultado de una exposición o en conjunto con un resultado de salud 30. En cuanto a todos los biomarcadores discutidos, están disponibles tanto la metabolómica dirigida, en la que se miden metabolitos específicos para caracterizar una vía de interés, así como enfoques metabolómicos no dirigidos. Entre las metodologías “ómicas”, la metabolómica interroga los niveles de un número relativamente menor de características ya que hay alrededor de 2900 metabolitos humanos conocidos frente a ~30,000 genes. Por lo tanto, tiene un fuerte poder estadístico en comparación con los estudios transcriptómicos de todo el genoma 31. La metabolómica es, por lo tanto, un método potencialmente sensible para identificar los efectos bioquímicos de los factores estresantes externos. Aunque el campo en desarrollo de la “metabolómica ambiental” busca emplear metodologías metabolómicas para caracterizar los efectos de las exposiciones ambientales sobre la función y la salud del organismo, aún no se ha estudiado la relación entre la mayoría de los químicos y sus efectos sobre el metaboloma humano.
Desafíos
Las limitaciones de los estudios epidemiológicos moleculares incluyen la dificultad de obtener muestras para estudiar, la necesidad de grandes poblaciones de estudio para identificar relaciones significativas entre la exposición y el biomarcador, la necesidad de métodos estadísticos complejos para analizar los datos. Para eludir el tema de la recolección de muestras, se ha enfocado mucho esfuerzo en eliminar la necesidad de muestras de sangre o suero mediante la utilización de muestras de saliva, células bucales o recortes de uñas para leer marcadores moleculares. Aunque estas muestras se pueden recolectar fácilmente de una manera no invasiva, se debe tener cuidado para demostrar que estas muestras reflejan con precisión la respuesta del cuerpo a la exposición en lugar de un efecto local. Para la metilación del ADN, se ha demostrado que esto depende en gran medida del locus en estudio. Para ciertos sitios CpG la correlación en los niveles de metilación es mucho mayor que para otros sitios 32. Para aquellos sitios que no se correlacionan bien entre tejidos, se ha demostrado además que los niveles de metilación del ADN pueden diferir en su asociación con los resultados clínicos 33, por lo que se debe tener cuidado en el diseño de estudios epidemiológicos para superar estos problemas.
Describir los 3 componentes del exposoma
Explicar cómo se pueden identificar biomarcadores utilizando el modelo meet in the middle
Dar 3 ejemplos de (bio) marcadores moleculares de exposición ambiental.
4.3.12. Expresión génica
Autor: Nico M. van Straalen
Críticos: Dick Roelofs, Dave Spurgeon
Objetivos de aprendizaje:
Deberías ser capaz de
- proporcionar una visión general de los diversos enfoques “ómicos” (genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica) desplegados en la toxicología ambiental.
- describir los aspectos prácticos de la transcriptómica, cómo se genera y analiza un perfil de transcripción.
- indican las ventajas y desventajas del uso de la expresión génica de todo el genoma en toxicología ambiental.
- desarrollar una idea sobre cómo la transcriptómica podría integrarse en la evaluación de riesgos de los productos químicos.
Palabras clave: genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica, evaluación de riesgos
Sinopsis
La exposición a bajas dosis a tóxicos induce cambios bioquímicos en un organismo, que tienen como objetivo mantener la homeostasis del ambiente interno y prevenir daños. Un aspecto de estos cambios es una gran abundancia de transcritos de enzimas de biotransformación, enzimas de defensa del estrés oxidativo, proteínas de choque térmico y muchas proteínas relacionadas con la respuesta celular al estrés. Tales mecanismos de defensa suelen ser altamente inducibles, es decir, su actividad está muy regulada al alza en respuesta a un tóxico. También se sabe que la mayoría de las respuestas al estrés son específicas del tipo de tóxico. Este principio puede revertirse: si se observa una respuesta de estrés regulada al alza, esto implica que el organismo está expuesto a cierto factor de estrés; la naturaleza del factor de estrés puede incluso derivarse del perfil de transcripción. Por esta razón, microarrays, secuenciación de ARN u otras técnicas de análisis de transcriptoma, se han aplicado en una gran variedad de contextos, tanto en experimentos de laboratorio como en encuestas de campo. Estos estudios sugieren que la transcriptómica obtiene puntajes altos en (en orden decreciente) (1) rapidez, (2) especificidad y (3) sensibilidad. Si bien las promesas de las aplicaciones genómicas en toxicología ambiental son altas, la mayoría de las aplicaciones se encuentran en estudios de modo de acción más que en la evaluación de riesgos.
Introducción
Ningún organismo está indefenso contra los tóxicos ambientales. Incluso a exposiciones por debajo de niveles fenotípicamente visibles sin efecto, una gran cantidad de mecanismos de defensa fisiológicos y bioquímicos ya están activos y contribuyen a la homeostasis del organismo. Estos mecanismos reguladores a menudo implican la regulación positiva de mecanismos de defensa como la defensa del estrés oxidativo, la biotransformación (metabolismo xenobiótico), las respuestas al choque térmico, la inducción de proteínas de unión a metales, la respuesta a la hipoxia, la reparación del daño del ADN, etc. Al mismo tiempo, se observa una regulación negativa para la energía metabolismo y funciones relacionadas con el crecimiento y la reproducción. Además de estos mecanismos regulatorios dirigidos dirigidos, por lo general hay muchos efectos secundarios y cambios disfuncionales derivados del daño. Se puede obtener una visión general completa de todos estos ajustes a partir del análisis del transcriptoma.
En este módulo revisaremos los diversos enfoques adoptados en “omics”, con énfasis en la transcriptómica. “Ómicas” es un término contenedor que comprende cinco actividades diferentes. En el cuadro 1 se presenta una lista de estos enfoques y su posible contribución a la toxicología ambiental. La genómica y la transcriptómica se ocupan de la secuenciación de ADN y ARNm, la proteómica se basa en la espectrometría de masas mientras que la metabolómica implica una variedad de técnicas de separación y detección, dependiendo de la clase de compuestos analizados. Los distintos enfoques ganan fuerza cuando se aplican conjuntamente. Por ejemplo, el análisis proteómico es mucho más perspicaz si puede vincularse a una secuencia genómica anotada y los estudios de metabolismo pueden sacar gran provecho de los perfiles de transcripción que incluyen las enzimas responsables de las reacciones metabólicas. La biología de sistemas tiene como objetivo integrar los diferentes enfoques utilizando modelos matemáticos. Sin embargo, es justo decir que la correlación entre las respuestas en los diferentes niveles suele ser bastante pobre. La sobrerregulación de un transcrito no siempre implica más proteína, se puede generar más proteína sin regulación positiva transcripcional y la concentración de un metabolito no siempre se correlaciona con la sobrerregulación de las enzimas que se supone que lo producen. En este módulo nos centraremos únicamente en la transcriptómica. La metabolómica se trata en una sección separada.
Cuadro 1. Panorama general de los distintos enfoques “ómicos”
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Término |
Descripción |
Relevancia para la toxicología ambiental |
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Genómica |
Secuenciación y ensamblaje del genoma, comparación de genomas, filogenética, análisis evolutivo |
Explicación de las diferencias de especies y linajes en susceptibilidad a partir de la estructura de dianas y potencial metabólico, relación entre toxicología, evolución y ecología |
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Transcriptómica |
Análisis de transcriptoma (ARNm) de todo el genoma, perfil de expresión génica |
Actividad indicadora de expresión de diana y metabolismo, análisis de modos de acción, diagnóstico de efectos específicos de sustancias, instrumento de alerta temprana para evaluación de riesgos |
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Proteómica |
Análisis del complemento proteico de la célula o tejido |
Metabolismo sistémico y desintoxicación, diagnóstico de estado fisiológico, efectos a largo plazo o permanentes |
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Metabolómica |
Análisis de todos los metabolitos de una determinada clase, análisis de vías |
Lectura funcional del estado fisiológico de una célula o tejido |
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Biología de sistemas |
Integración de los distintos enfoques “ómicos”, análisis de redes, modelización |
Comprensión de respuestas coherentes, extrapolación a respuestas fenotípicas de todo el cuerpo |
Análisis transcriptómico
El objetivo de la transcriptómica en toxicología ambiental es obtener una visión completa de todos los cambios en la abundancia de ARNm en una célula o tejido en función de la exposición a químicos ambientales. Esto se suele hacer en la siguiente secuencia de pasos:
- Exposición de organismos a un tóxico ambiental, incluyendo un rango de concentraciones, puntos de tiempo, etc., dependiendo de los objetivos del experimento.
- Aislamiento de ARN total de individuos o una muestra de individuos agrupados. El número de réplicas biológicas se determina en esta etapa, por el número de aislamientos de ARN independientes, no por replicación técnica más adelante en el procedimiento.
- Transcripción inversa. Los ARNm se transcriben a ADNc usando la enzima transcriptasa inversa que se inicia en la cola poliA de los ARNm. Debido a que el ARN ribosómico carece de una cola poli (A), (en principio) no se transcriben a ADNc. Esto es seguido por la selección de tamaño y algunas veces el etiquetado de los ADNc con códigos de barras para facilitar la secuenciación.
- Secuenciación del pool de ADNc y ensamblaje de transcriptoma. El ensamblaje preferiblemente hace uso de un genoma de referencia para la especie.Si no se dispone de genoma de referencia, el transcriptoma se ensambla de novo, lo que requiere una mayor profundidad de secuenciación y generalmente termina en muchos transcritos incompletos. Se aplican diversas correcciones para igualar efectos de rendimiento de ARN total, tamaño de biblioteca, profundidad de secuenciación, longitud de genes, etc.
- Análisis de la expresión génica y estimación de la regulación de veces. Esto se hace, en principio, contando el número normalizado de transcritos por gen para cada gen del genoma, para cada una de las diferentes condiciones a las que estuvo expuesto el organismo. La respuesta por gen se expresa como regulación de veces, expresando los transcritos en relación con una condición estándar o control. Se realizan pruebas para separar los cambios significativos del ruido.
- Anotación y evaluación de vías y funciones influenciadas por la exposición. Se desarrolla un cuadro integrador, tomando todas las evidencias juntas, de los cambios funcionales en el organismo.
En el pasado reciente, el paso 4 se realizó mediante hibridación de micromatrices en lugar de mediante secuenciación directa. En esta técnica se hibridan dos conjuntos de ADNc (por ejemplo, un control y un tratamiento) a un gran número de sondas fijadas en una pequeña placa de vidrio. Las sondas están diseñadas para representar el complemento génico completo del organismo. Las señales de hibridación positivas se toman como evidencia para la expresión génica regulada por incremento. La hibridación de micromatrices surgió en los años 1995-2005, pero ahora ha sido superada en gran medida por métodos de secuenciación de próxima generación ultrarrápidos y de alto rendimiento, sin embargo, debido a la rentabilidad, la relativa simplicidad del análisis bioinformático y la estandarización de los genes evaluados, todavía se usa a menudo.
Ilustramos los principios del análisis transcriptómico y el tipo de análisis de datos que le sigue, mediante un ejemplo del trabajo de Bundy et al. (2008). Estos autores expusieron las lombrices de tierra (Lumbricus rubellus) a suelos modificados experimentalmente con cobre, un elemento bastante tóxico para las lombrices de tierra. El transcriptoma inducido por cobre se encuestó utilizando un microarray hecho a medida y se establecieron perfiles metabólicos mediante espectroscopía de RMN (resonancia magnética nuclear). De las 8,209 sondas en la micromatriz, 329 mostraron una alteración significativa de la expresión bajo la influencia del cobre. Los datos se graficaron en un diagrama de “mapa de calor” (Figuras 1A y 1B), proporcionando una visión general rápida de los genes regulados por incremento y regulación negativa. Los perfiles de expresión también se analizaron en dimensionalidad reducida mediante análisis de componentes principales (PCA). Esto mostró que los perfiles variaron considerablemente con el tratamiento. Especialmente las exposiciones más altas y penúltimas más altas generaron un perfil muy diferente al testigo (ver Figura 1C). Los genes podrían asignarse a cuatro grupos, (1) genes regulados positivamente por el cobre sobre todas las exposiciones (Figura 1D), (2) genes regulados negativamente por el cobre (ver Figura 1E), (3) genes regulados al alza por exposiciones bajas pero no afectados a exposiciones más altas (ver Figura 1F), y (4) genes regulados al alza por baja exposición pero regulados negativamente por concentraciones más altas (ver Figura 1G). El análisis de identidad génica combinado con el análisis de metabolitos sugiere que los cambios se debieron a un efecto del cobre sobre la respiración mitocondrial, reduciendo la cantidad de energía generada por la fosforilación oxidativa. Este mecanismo fue subyacente a la reducción del crecimiento corporal observada a nivel fenotípico.
Ómica en la evaluación de riesgos
¿Cómo podría contribuir la omics-tecnología, especialmente la transcriptómica, a la evaluación de riesgos de los productos químicos? Se han presentado tres posibles ventajas:
- El análisis de la expresión génica es rápido. La regulación génica se lleva a cabo en una escala de tiempo de horas y los resultados se pueden obtener en pocos días. Esto se compara muy favorablemente con las pruebas de toxicidad tradicionales (Daphnia, 48 horas, Folsomia, 28 días).
- La expresión génica es específica. Debido a que un perfil de transcripción involucra de cientos a miles de puntos finales (genes), el contenido de la información es potencialmente muy grande. Al comparar un nuevo perfil generado por un compuesto desconocido, con un conjunto de datos entrenados, el compuesto generalmente se puede identificar con bastante precisión.
- La expresión génica es sensible. Debido a que la regulación génica se encuentra entre las primeras respuestas bioquímicas en un organismo, se espera que responda a dosis más bajas, en las que los parámetros de todo el cuerpo como la supervivencia, el crecimiento y la reproducción aún no responden.
Entre estas ventajas, la segunda (especificidad) ha demostrado ser la más consistente y posiblemente trae la mayor ventaja. Esto puede ser ilustrado por un estudio de Dom et al. (2012) en la que se generaron perfiles de expresión génica para Daphnia magna expuesta a diferentes alcoholes y anilinas cloradas (Figura 2).
Los perfiles de réplicas expuestas al mismo compuesto siempre se agruparon, excepto en un caso (etanol), demostrando que la expresión génica es bastante específica del compuesto. Es posible revertir este argumento: del perfil de expresión génica se puede deducir el compuesto causante del mismo. Además, el ejemplo citado mostró que la primera separación en el análisis de conglomerados fue entre exposiciones que afectaron y no afectaron las reservas de energía y el crecimiento. Por lo que los perfiles de expresión génica no sólo son indicativos del compuesto, sino también del tipo de efectos esperados.
El reclamo de rapidez también resultó cierto, sin embargo, la ventaja de la rapidez no siempre se confirma. Puede ser un problema cuando las decisiones rápidas son cruciales (evaluar un camión cargado con suelo sospechoso contaminado, decidir si descargar una cierta corriente de desechos en un lago sí o no), pero para los procedimientos regulares de evaluación de riesgos resultó ser menos de una ventaja de lo que a veces se esperaba. Finalmente, una mayor sensibilidad de la expresión génica, en el sentido de concentraciones de efecto no observadas menores que los criterios de valoración clásicos, es una ventaja potencial, pero demuestra ser menos espectacular en la práctica. Sin embargo, hay claros ejemplos en los que se demostró que exposiciones por debajo de los niveles de efecto fenotípico inducen respuestas de expresión génica, lo que indica que el organismo fue capaz de compensar cualquier efecto negativo ajustando su bioquímica.
Otra estrategia con respecto al uso de la expresión génica en la evaluación del riesgo no es enfocarse en transcriptomas de todo el genoma sino en genes biomarcadores seleccionados. En esta estrategia, se buscan expresiones génicas que muestren (1) dependencia consistente de la dosis, (2) respuestas sobre una amplia gama de contaminantes y (3) correlaciones con el daño biológico. Por ejemplo, De Boer et al. (2015) analizó un conjunto de datos compuestos que incluyó experimentos con seis metales pesados, seis anilinas cloradas, tetraclorobenceno, fenantreno, diclofenaco e isotiocianato, todos previamente utilizados en experimentos estandarizados con el colémbolano vivo en el suelo, Folsomia candida. En todos los tratamientos se realizó una selección de 61 genes, que respondieron en todos los casos y cumplieron con los tres criterios enumerados anteriormente. Algunos de estos genes marcadores mostraron una respuesta muy buena y reproducible relacionada con la dosis a la contaminación del suelo. En la Figura 3 se muestran dos biomarcadores. Este experimento, diseñado para diagnosticar un suelo de campo con contaminación compleja desconocida, demostró claramente la presencia de tóxicos orgánicos inductores de Cyp.
Por supuesto, también hay desventajas asociadas a la transcriptómica en la toxicología ambiental, por ejemplo:
- El análisis de la expresión génica requiere una infraestructura intensiva en conocimiento, incluyendo un alto nivel de experiencia para algunos de los análisis bioinformáticos. Además, se necesitan instalaciones adecuadas de laboratorio molecular; algunas técnicas son bastante costosas.
- El análisis de la expresión génica es más fructífero cuando se utilizan especies que están respaldadas por recursos genómicos adecuados, especialmente un ensamblaje genómico bien anotado, aunque esto se está convirtiendo en un problema menor con la creciente disponibilidad de recursos genómicos.
- La relación entre la expresión génica y variables ecológicamente relevantes como el crecimiento y reproducción del animal no siempre es clara.
Conclusiones
El análisis de la expresión génica ha llegado a ocupar un nicho designado en la toxicología ambiental desde aproximadamente 2005. Es un campo altamente impulsado por la tecnología, y muestra un cambio continuo en los últimos años. Puede contribuir significativamente a la evaluación del riesgo en el contexto de estudios de modo de acción y como fuente de técnicas de biomarcadores designados. Finalmente, los datos transcriptómicos son muy adecuados para alimentar información sobre eventos clave, importantes alteraciones bioquímicas que se vinculan causalmente hasta el nivel del fenotipo para formar una vía de desenlace adverso. Nos remitimos a la sección sobre Vías de resultados adversos para su posterior lectura.
Referencias
Bundy, J.G., Sidhu, J.K., Rana, F., Spurgeon, D.J., Svendsen, C., Wren, J.F., Stürzenbaum, S.R., Morgan, A.J., Kille, P. (2008). El enfoque de “Toxicología de sistemas” identifica respuestas metabólicas coordinadas al cobre en un invertebrado terrestre no modelo, la lombriz Lumbricus rubellus. BMC Biología 6, 25.
De Boer, T.E., Janssens, T.K.S., Legler, J., Van Straalen, N.M., Roelofs, D. (2015). Análisis transcriptómico combinado para la clasificación de los efectos adversos como un posible punto final en el cribado basado en efectos. Ciencia y Tecnología Ambiental 49, 14274-14281.
Dom, N., Vergauwen, L., Vandenbrouck, T., Jansen, M., Blust, R., Knapen, D. (2012). Evaluación del efecto fisiológico y molecular versus esquemas de modo de acción basados en fisicoquímica: Daphnia magna expuesta a narcóticos y narcóticos polares. Ciencia y Tecnología Ambiental 46, 10-18.
Gibson, G., Muse, S.V. (2002). Una cartilla de la ciencia del genoma. Sinauer Associates Inc., Sunderland.
Gibson, G. (2008). La contribución ambiental a los perfiles de expresión génica. Naturaleza Opiniones Genética 9, 575-581.
Roelofs, D., De Boer, M., Agamennone, V., Bouchier, P., Legler, J., Van Straalen, N. (2012). Genómica ambiental funcional de un suelo de relleno sanitario municipal. Fronteras en Genética 3, 85.
Van Straalen, N.M., Feder, M.E. (2012). Genómica funcional ecológica y evolutiva: ¿cómo puede contribuir a la evaluación de riesgos de los productos químicos? Ciencia y Tecnología Ambiental 46, 3-9.
Van Straalen, N.M., Roelofs, D. (2008). Tecnología genómica para evaluar la contaminación del suelo . Revista de Biología 7, 19.
Definir: (1) genómica, (2) transcriptómica (3) proteómica y (4) metabolómica, e indicar cuál de estos enfoques es más útil en la evaluación de riesgos de químicos.
Especificar tres ventajas y al menos una desventaja del uso de la expresión génica en todo el genoma como herramienta en la evaluación de riesgos ambientales.
4.3.13. Metabolómica
Autor: Pim E.G. Leonards
Revisores: Nico van Straalen, Drew Ekman
Objetivos de aprendizaje:
Deberías ser capaz de:
- comprende los conceptos básicos de la metabolómica y cómo se puede usar la metabolómica.
- describir los principios básicos del análisis metabolómico y cómo se genera y analiza un perfil metabólico.
- describir las diferencias entre metabolómica dirigida y no dirigida y cómo se usa cada una en toxicología ambiental.
- desarrollar una idea sobre cómo la metabolómica podría integrarse en las evaluaciones de peligros y riesgos de los productos químicos.
Palabras clave: Metabolómica, metaboloma, metabolómica ambiental, áreas de aplicación de metabolómica, metabolómica dirigida y no dirigida, análisis metabolómica y flujo de trabajo
Introducción
La metabolómica es el estudio sistemático de pequeñas moléculas orgánicas (<1000 Da) que son intermedios y productos formados en células y biofluidos debido a procesos metabólicos. Una gran variedad de moléculas pequeñas resultan de la interacción entre genes, proteínas y metabolitos. Los principales tipos de moléculas orgánicas pequeñas estudiadas son metabolitos endógenos (es decir, aquellos que ocurren naturalmente en la célula) como azúcares, aminoácidos, neurotransmisores, hormonas, vitaminas y ácidos grasos. El número total de metabolitos endógenos en un organismo aún está en estudio pero se estima que es de miles. Sin embargo, este número varía considerablemente entre especies y tipos de células. Por ejemplo, las células cerebrales contienen niveles relativamente altos de neurotransmisores y lípidos, sin embargo los niveles entre diferentes tipos de tejidos cerebrales pueden variar en gran medida. Los metabolitos están trabajando en una red, por ejemplo, el ciclo del ácido cítrico, mediante la conversión de moléculas por enzimas. El tiempo de recambio de los metabolitos está regulado por las enzimas presentes y la cantidad de metabolitos presentes.
El campo de la metabolómica es relativamente nuevo en comparación con la genómica, con el primer borrador del metaboloma humano disponible en 2007. Sin embargo, el campo ha crecido rápidamente desde entonces debido a su reconocida capacidad para reflejar los cambios moleculares más estrechamente asociados con el fenotipo de un organismo. De hecho, en comparación con otros enfoques 'ómicos (por ejemplo, transcriptómica), los metabolitos son los resultados aguas abajo de la acción de genes y proteínas y, como tales, proporcionan un vínculo directo con el fenotipo (Figura 1). El estado metabólico de un organismo está directamente relacionado con su función (por ejemplo, el estado energético, oxidativo, endocrino y reproductivo) y su fenotipo y, por lo tanto, es especialmente adecuado para relacionar el estrés químico con el estado de salud de los organismos. Además, transcriptómica y proteómica, la identificación de metabolitos no requiere la existencia de secuencias génicas, lo que la hace particularmente útil para aquellas especies que carecen de un genoma secuenciado.
Definiciones
El conjunto de moléculas pequeñas en un sistema biológico (e.g., células, fluidos corporales, tejidos, organismo) se denomina metaboloma (Cuadro 1). El término metabolómica fue introducido por Oliver et al. (1998) quienes lo describieron “como el conjunto completo de metabolitos/compuestos de bajo peso molecular que es dependiente del contexto, variando según la fisiología, desarrollo o estado patológico de la célula, tejido, órgano u organismo”. Esta cita destaca la observación de que los niveles de metabolitos pueden variar debido a factores internos y externos, incluido el estrés resultante de la exposición a contaminantes ambientales. Esto ha dado lugar a la emergencia y crecimiento del campo de la metabolómica ambiental que se basa en la aplicación de la metabolómica, a sistemas biológicos que están expuestos a contaminantes ambientales y otros factores estresantes relevantes (por ejemplo, la temperatura). Además de los metabolitos endógenos, algunos estudios metabolómicos también miden cambios en la biotransformación de contaminantes ambientales, aditivos alimentarios o fármacos en las células, cuya colección se ha denominado xenometaboloma.
Cuadro 1: Definiciones de metabolómica.
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Término |
Definición |
Relevancia para la toxicología ambiental |
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Metabolómica |
Análisis de pequeñas moléculas orgánicas (<1000 Da) en sistemas biológicos (e.g., célula, tejido, organismo) |
Lectura funcional del estado fisiológico de una célula o tejido y directamente relacionada con el fenotipo |
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Metaboloma |
Medición del conjunto de moléculas pequeñas de c omplete en un sistema biológico |
Descubrimiento de vías metabólicas afectadas por exposición a contaminantes |
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Metabolómica ambiental |
Análisis metabolómico en sistemas biológicos expuestos al estrés ambiental, como la exposición a contaminantes ambientales |
Metabolómica centrada en la exposición a contaminantes ambientales para estudiar por ejemplo el mecanismo de toxicidad o para encontrar un biomarcador de exposición o efecto |
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Xenometaboloma |
Metabolitos formados a partir de la biotransformación de contaminantes ambientales, aditivos alimentarios o drogas |
Comprender el metabolismo del contaminante objetivo |
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Metabolómica dirigida |
Análisis de un conjunto preseleccionado de metabolitos en un sistema biológico |
Enfoque en los efectos de los contaminantes ambientales en vías metabólicas específicas |
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Metabolómica no dirigida |
Análisis de todos los metabolitos detectables (es decir, no preseleccionados) en un sistema biológico |
Análisis basado en el descubrimiento de las vías metabólicas afectadas por la exposición a contaminantes ambientales |
Análisis de Metabolómica Ambiental
El desarrollo y la aplicación exitosa de la metabolómica se basa en gran medida en i) las técnicas analíticas actualmente disponibles que miden metabolitos en células, tejidos y organismos, ii) la identificación de las estructuras químicas de los metabolitos, y iii) la caracterización de la variabilidad metabólica dentro células, tejidos y organismos.
El objetivo del análisis metabolómico en toxicología ambiental puede ser:
- enfocarse en los cambios en la abundancia de metabolitos específicos en un sistema biológico
después de la exposición a contaminantes ambientales: metabolómica dirigida
- proporcionar una visión general “completa” de los cambios en la abundancia de todos los metabolitos detectables en un sistema biológico después de la exposición a contaminantes ambientales: metabolómica no dirigida
En la metabolómica dirigida se analiza cuantitativamente un número limitado de metabolitos preseleccionados (típicamente 1-100) (por ejemplo, nmol de dopamina/g de tejido). Por ejemplo, los metabolitos en la vía biosintética de los neurotransmisores podrían ser dirigidos para evaluar las exposiciones a pesticidas. El objetivo de metabolitos específicos de esta manera generalmente permite su detección a bajas concentraciones con alta precisión. Por el contrario, en la metabolómica no dirigida el objetivo es detectar tantos metabolitos como sea posible, independientemente de sus identidades para evaluar la mayor cantidad posible del metaboloma. El mayor desafío para la metabolómica no dirigida es la identificación (anotación) de las estructuras químicas de los metabolitos detectados. Actualmente no existe un método analítico único capaz de detectar todos los metabolitos en una muestra, por lo que se utiliza una combinación de diferentes técnicas analíticas para detectar el metaboloma. Se requieren diferentes técnicas debido a la amplia gama de propiedades físico-químicas de los metabolitos. La variedad de estructuras químicas de metabolitos se muestra en la Figura 2. Los metabolitos pueden agruparse en clases como los ácidos grasos (las clases se dan entre paréntesis en la Figura 2), y dentro de una clase se pueden encontrar diferentes metabolitos.
Un flujo de trabajo general de análisis de metabolómica ambiental utiliza los siguientes pasos:
- del organismo o las células a un contaminante ambiental. También se debe incluir un grupo de control no expuesto. Las exposiciones suelen incluir el uso de diversas concentraciones, puntos de tiempo, etc., dependiendo de los objetivos del estudio.
- Recolección de muestras del material biológico relevante (e.g., célula, tejido, organismo). Es importante que la recolección se haga lo más rápido posible para apagar cualquier metabolismo posterior. Por lo general, se utilizan disolventes fríos con hielo.
- de los metabolitos de la célula, tejido u organismos mediante una extracción en dos etapas usando una combinación de disolventes de extracción polares (por ejemplo, agua/metanol) y apolares (por ejemplo, cloroformo).
- de las fracciones polares y apolares mediante cromatografía líquida (LC) o cromatografía de gases (GC) combinada con espectrometría de masas (MS), o mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). La (s) herramienta (s) analítica (s) utilizada (s) dependerá de los metabolitos bajo consideración y de si se requiere un enfoque dirigido o no dirigido.
- Detección de metabolitos (análisis dirigido o no dirigido).
- Metabolómica dirigida: se detecta un conjunto específico de metabolitos preseleccionados y sus concentraciones se determinan utilizando estándares auténticos.
- Metabolómica no dirigida: se recoge una lista de todos los metabolitos detectables medidos por la respuesta de EM o RMN, y sus intensidades. Luego se utilizan diversas técnicas para determinar las identidades de aquellos metabolitos que cambian debido a la exposición (ver paso 7 a continuación).
- Análisis estadístico utilizando estadísticas univariadas y multivariadas para calcular la diferencia entre los grupos de exposición y control. Se determina el cambio en veces (veces aumento o disminución de los niveles de metabolitos) entre un grupo de exposición y control.
- Para la metabolómica no dirigida solo se identifica la estructura química de los metabolitos estadísticamente significativos. La identificación de la estructura química del metabolito puede basarse en el peso molecular, patrones de isótopos, composiciones elementales, patrones de fragmentación por espectrometría de masas, etc. Para la identificación se utilizan bibliotecas de espectrometría de masas para que coincidan con los parámetros anteriores en las muestras con los datos en bibliotecas.
- Procesamiento de datos: Identificación de las vías metabólicas influenciadas por la exposición química. Imagen integradora del nivel molecular y funcional de un organismo por exposición química. Comprender la relación entre la exposición química, los cambios en las vías moleculares y la toxicidad observada. O para identificar posibles biomarcadores de exposición o efecto.
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Cuadro: Herramientas analíticas para el análisis metabolómico Las herramientas analíticas más utilizadas para medir metabolitos son la espectrometría de masas (EM) y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). La EM es una herramienta analítica que genera iones de moléculas y luego mide sus relaciones masa-carga. Esta información puede ser utilizada para generar una “huella molecular” para cada molécula, y en base a esta huella dactilar se pueden identificar metabolitos. La cromatografía se utiliza típicamente para separar los diferentes metabolitos de una mezcla que se encuentra en una muestra antes de que entre en el espectrómetro de masas. En metabolómica se utilizan dos técnicas principales de cromatografía: cromatografía líquida y cromatografía de gases. Debido a su alta sensibilidad, la EM es capaz de medir una gran cantidad de metabolitos diferentes simultáneamente. Además, cuando se combina con un método de separación como la cromatografía, la EM puede detectar e identificar miles de metabolitos. La espectrometría de masas es mucho más sensible que la RMN, y puede detectar una amplia gama de diferentes tipos de metabolitos con diferentes propiedades físico-químicas. La RMN es menos sensible y, por lo tanto, puede detectar un menor número de metabolitos (típicamente 50-200). Las ventajas de la RMN son la cantidad mínima de manejo de la muestra, la reproducibilidad de las mediciones (debido a la alta precisión), y es más fácil cuantificar los niveles de metabolitos. Además, la RMN es una técnica no destructiva tal que una muestra a menudo puede ser utilizada para análisis posteriores después de que se hayan adquirido los datos. |
Aplicación de metabolómica ambiental
La metabolómica ha sido ampliamente utilizada en el descubrimiento de fármacos y las ciencias médicas. Más recientemente, la metabolómica se está incorporando a los estudios ambientales, un campo emergente de investigación llamado metabolómica ambiental. La metabolómica ambiental se utiliza principalmente en cinco dominios de aplicación (Cuadro 2). Podría decirse que la aplicación más utilizada es para estudiar el mecanismo de toxicidad/modo de acción (MoA) de los contaminantes. Sin embargo, muchos estudios han identificado metabolitos seleccionados que se muestran prometedores para su uso como biomarcadores de exposición o efecto. Como resultado de su fuerza en la identificación de huellas dactilares de respuesta, la metabolómica también está encontrando uso en el campo de la toxicología regulatoria, particularmente para estudios de lectura cruzada. Esta aplicación es particularmente útil para detectar rápidamente la toxicidad de los contaminantes. La metabolómica también se puede utilizar en estudios de dosis-respuesta (dosificación de referencia) para derivar un punto de partida (POD). Esto es especialmente interesante en la evaluación de riesgos químicos regulatorios.
Actualmente, el campo de la toxicología de sistemas se explora combinando datos de diferentes campos ómicos (por ejemplo, transcriptómica, proteómica, metabolómica) para mejorar nuestra comprensión de la relación entre las diferentes ómicas, exposición química y toxicidad, y para comprender mejor el mecanismo de toxicidad/ MoA.
Cuadro 2: Áreas de aplicación de metabolómica en toxicología ambiental.
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Área de aplicación |
Descripción |
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Mecanismo de toxicidad/ Modo de acción (MoA) |
Utilizar la metabolómica para comprender a nivel molecular las vías que se ven afectadas por la exposición a contaminantes ambientales. Descubrimiento del modo de acción de los químicos. En una vía de resultados adversos (AOP), la metabolómica de descubrimiento se utiliza para identificar los eventos clave (KE), vinculando la exposición química a nivel molecular con criterios de valoración funcionales (por ejemplo, reproducción, comportamiento). |
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Descubrimiento de biomarcadores |
Identificación de metabolitos que pueden ser utilizados como indicadores convenientes (es decir, fáciles y económicos de medir) de exposición o efecto. |
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Lectura a través |
En toxicología regulatoria, la metabolómica se utiliza en estudios de lectura cruzada para proporcionar información sobre la similitud de las respuestas entre los químicos. Este enfoque es útil para identificar químicos más tóxicos para el medio ambiente. |
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Punto de partida |
La metabolómica se puede utilizar en estudios dosis-respuesta (dosificación de referencia) para derivar un punto de partida (POD). Esto es especialmente interesante en la evaluación de riesgos químicos regulatorios. Actualmente esta aplicación aún no se utiliza. |
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Toxicología de sistemas |
Enfoque combinado de diferentes ómicas (por ejemplo, transcriptómica, proteómica, metabolómica) para mejorar nuestra comprensión de la relación entre las diferentes ómicas y la exposición química, y para comprender mejor el mecanismo de toxicidad/MoA. |
Como ilustración del mecanismo de aplicación de toxicidad/modo de acción, Bundy et al. (2008) utilizaron metabolómica basada en NMR para estudiar lombrices de tierra (Lumbricus rubellus) expuestas a diversas concentraciones de cobre en el suelo (0, 10, 40, 160, 480 mg cobre/kg suelo). Realizaron estudios transcriptómicos y metabolómicos. Se analizaron los metabolitos polares (azúcares, aminoácidos, etc.) y apolares (lípidos), y se determinaron los cambios en veces en relación con el grupo control. Por ejemplo, las diferencias en los cambios de veces de metabolitos lipídicos (por ejemplo, ácidos grasos, triacilglicerol) en función de la concentración de cobre se muestran como un “mapa de calor” en la Figura 3A. Claramente, el grupo de dosis más alta (480 mg/kg) tiene un patrón de metabolitos lipídicos muy diferente al de los otros grupos. Los datos de metabolitos polares se analizaron mediante el análisis de componentes principales (ACP), una herramienta estadística multivariada que reduce el número de dimensiones de los datos. La gráfica de puntuación de PCA mostrada en la Figura 3B revela que las mayores diferencias en los perfiles de metabolitos existen entre: los grupos control y dosis baja (10 mg Cu/kg), los grupos de 40 mg Cu/kg y 160 mg Cu/kg, y el grupo de dosis más alta (480 mg Cu/kg) (Figura 3B). Estas separaciones indican que los patrones de metabolitos en estos grupos fueron diferentes como resultado de las diferentes exposiciones al cobre. Algunos de los metabolitos estaban arriba y algunos fueron regulados negativamente debido a la exposición al cobre (dos ejemplos dados en las Figuras 3c y 3D). Los datos de metabolitos también se combinaron con datos de expresión génica en una aplicación de toxicología de sistemas. Este análisis combinado mostró que las exposiciones al cobre provocaron la alteración del metabolismo energético, particularmente en lo que respecta a los efectos sobre las mitocondrias y la fosforilación oxidativa. Bundy et al. asociaron este efecto sobre el metabolismo energético con una tasa de crecimiento reducida de las lombrices de tierra. Este estudio demostró efectivamente que la metabolómica puede usarse para comprender las vías de metabolitos que se ven afectadas por la exposición al cobre y están estrechamente relacionadas con cambios fenotípicos (es decir, reducción de la tasa de crecimiento). Los datos del transcriptoma recolectados simultáneamente estuvieron en buena concordancia con los patrones del metaboloma, apoyando a Bundy et al. ' La hipótesis de que la medición simultánea de los transcriptomas y metabolomas puede ser utilizada para validar los hallazgos de ambos enfoques, y a su vez el valor de la “toxicología de sistemas”.
Desafíos en metabolómica
Actualmente existen varios retos en el campo de la metabolómica. Desde una perspectiva biológica, el metabolismo es un proceso dinámico y por lo tanto muy sensible al tiempo. Tomar muestras en diferentes momentos durante el desarrollo de un organismo, o a lo largo de una exposición química puede resultar en patrones de metabolitos bastante diferentes. El manejo y almacenamiento de muestras también pueden ser desafiantes ya que algunos metabolitos son muy inestables durante la recolección de muestras y el tratamiento de la muestra Desde una perspectiva analítica, los metabolitos poseen una amplia gama de propiedades fisicoquímicas y ocurren en concentraciones muy variables de tal manera que capturar la porción más amplia del metaboloma requiere análisis con más de una técnica analítica. Sin embargo, el mayor desafío es posiblemente la identificación de la estructura química de metabolitos desconocidos. Incluso con técnicas analíticas de última generación, solo se puede identificar con confianza una fracción de los metabolitos desconocidos.
Conclusiones
La metabolómica es un campo relativamente nuevo en toxicología, pero está aumentando rápidamente nuestra comprensión de las vías bioquímicas afectadas por la exposición a contaminantes ambientales, y a su vez sus mecanismos de acción. Vincular las vías moleculares cambiadas debido a la exposición de contaminantes a cambios fenotípicos de los organismos es un área de gran interés. Los continuos avances en herramientas analíticas de última generación para la detección e identificación de metabolitos continuarán a esta tendencia y ampliarán la utilidad de la metabolómica ambiental para priorizar contaminantes. Sin embargo, quedan varios desafíos para el uso generalizado de la metabolómica en la toxicología regulatoria. Afortunadamente, el reciente crecimiento del interés internacional para abordar estos desafíos está en marcha, y está dando grandes avances en una variedad de aplicaciones.
Referencias
Bundy, J.G., Sidhu, J.K., Rana, F., Spurgeon, D.J., Svendsen, C., Wren, J.F., Sturzenbaum, S.R., Morgan, A.J., Kille, P. (2008). El enfoque de 'Toxicología de sistemas' identifica respuestas metabólicas coordinadas al cobre en un invertebrado terrestre no modelo, la lombriz Lumbricus rubellus. BMC Biología, 6 (25), 1-21.
Bundy, J.G., Matthew P. Davey, M.P., Viant, M.R. (2009). Metabolómica ambiental: una revisión crítica y perspectivas de futuro. Metabolómica, 5, 3-21.
Johnson, C.H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. (2016). Metabolómica: más allá de los biomarcadores y hacia los mecanismos. Revisiones de la Naturaleza, Biología Molecular y Celular 17, 451-459.
¿Qué tipo de moléculas se miden con metabolómica?
Proteínas
Moléculas pequeñas
Genes
Polímeros
¿Cuáles son las áreas de aplicación típicas de la metabolómica ambiental?
Dar cuatro elementos principales del flujo de trabajo de la metabolómica, y describir dos con más detalle?