15.5: Evaluación de la Luminiscencia Molecular

Escala de Operación

La espectroscopia de fotoluminiscencia se utiliza para el análisis rutinario de analitos de traza y ultratraza en muestras macro y meso. Los límites de detección para espectroscopía de fluorescencia están influenciados por el rendimiento cuántico del analito. Para un analito con\(\Phi_f > 0.5\), es posible un límite de detección picomolar cuando se usa un espectrofluorómetro de alta calidad. Por ejemplo, el límite de detección para el sulfato de quinina, para el cual\(\Phi\) es de 0.55, generalmente está entre 1 parte por mil millones y 1 parte por billón. Los límites de detección de fosforescencia son algo mayores, con valores típicos en el rango nanomolar para la fosforimetría a baja temperatura y en el rango micromolar para la fosforimetría a temperatura ambiente usando un sustrato sólido.

Precisión

La precisión de un método de fluorescencia generalmente está entre 1— 5% cuando las interferencias espectrales y químicas son insignificantes. La precisión está limitada por los mismos tipos de problemas que afectan a otros métodos espectroscópicos ópticos. Además, la precisión se ve afectada por interferencias que afectan el rendimiento cuántico fluorescente. La precisión de la fosforescencia es algo mayor que la de la fluorescencia.

Precisión

La desviación estándar relativa para la fluorescencia suele estar entre 0.5— 2% cuando la concentración del analito está muy por encima de su límite de detección. La precisión suele estar limitada por la estabilidad de la fuente de excitación. La precisión de la fosforescencia a menudo está limitada por la reproducibilidad en la preparación de muestras para el análisis, siendo comunes las desviaciones estándar relativas del 5— 10%.

Sensibilidad

La sensibilidad de un método fluorescente o fosforescente se ve afectada por una serie de parámetros. Ya hemos considerado la importancia del rendimiento cuántico y el efecto de la temperatura y la composición de la solución sobre\(\Phi_f\) y\(\Phi_p\). Además del rendimiento cuántico, la sensibilidad se mejora mediante el uso de una fuente de excitación que tiene una mayor intensidad de emisión, P ₀, a la longitud de onda deseada, y seleccionando una longitud de onda de excitación para la que el analito tenga una mayor absortividad molar,\(\varepsilon\). Otro enfoque para mejorar la sensibilidad es aumentar el volumen a partir del cual se monitorea la emisión. La figura\(\PageIndex{1}\) muestra cómo la rotación de las ranuras de un monocromador desde su orientación vertical habitual a una orientación horizontal aumenta el volumen de muestreo. El resultado puede aumentar la emisión de la muestra por\(5-30 \times\).

Figura\(\PageIndex{1}\). Uso de la orientación de la hendidura para cambiar el volumen a partir del cual se mide la fluorescencia: (a) orientación vertical de la hendidura; (b) orientación horizontal de la hendidura. Supongamos que las dimensiones de la hendidura son 0.1 mm\(\times\) 3 mm. En (a) las dimensiones del volumen de muestreo son 0.1 mm\(\times\) 0.1 mm\(\times\) 3 mm, o 0.03 mm ³. Para (b) las dimensiones del volumen de muestreo son 0.1 mm\(\times\) 3 mm\(\times\) 3 mm, o 0.9 mm ³, un aumento de 30 veces en el volumen de muestreo.

Selectividad

La selectividad de fluorescencia y fosforescencia es superior a la de la espectrofotometría de absorción por dos razones: primero, no todos los compuestos que absorben radiación son fluorescentes o fosforescentes; y, segundo, la selectividad entre un analito y un interferente es posible si hay una diferencia en cualquiera de los dos su excitación o sus espectros de emisión. La intensidad de emisión total es una suma lineal de la de cada especie fluorescente o fosforescente. El análisis de una muestra que contiene n analitos, por lo tanto, se realiza midiendo la intensidad de emisión total a n longitudes de onda.

Tiempo, Costo y Equipo

Al igual que con otros métodos espectroscópicos ópticos, los métodos fluorescentes y fosforescentes proporcionan un medio rápido para analizar muestras y son capaces de automatización. Los fluorómetros son relativamente económicos, van desde varios cientos hasta varios miles de dólares, y a menudo son satisfactorios para el trabajo cuantitativo. Los espectrofluorómetros son más caros, ya que los modelos suelen superar los 50,000 dólares.