26.1: Una descripción general de la cromatografía

En cromatografía pasamos una fase libre de muestra, que llamamos la fase móvil, sobre una segunda fase estacionaria libre de muestra que permanece fija en el espacio (Figura\(\PageIndex{1}\)). Inyectamos o colocamos la muestra en la fase móvil. A medida que la muestra se mueve con la fase móvil, sus componentes se reparten entre la fase móvil y la fase estacionaria. Un componente cuya relación de distribución favorece la fase estacionaria requiere más tiempo para pasar por el sistema. Dado el tiempo suficiente y la suficiente fase estacionaria y móvil, podemos separar los solutos aunque tengan relaciones de distribución similares.

Figura\(\PageIndex{1}\). En cromatografía pasamos una fase móvil sobre una fase estacionaria. Cuando inyectamos una muestra en la fase móvil, los componentes de la muestra se mueven con la fase móvil y se separan en la fase estacionaria. El soluto que más tiempo pasa en la fase estacionaria tarda más tiempo en moverse por el sistema.

Clasificación de Métodos Cromatográficos

Hay muchas maneras en las que podemos identificar una separación cromatográfica: describiendo el estado físico de la fase móvil y la fase estacionaria; describiendo cómo ponemos la fase estacionaria y la fase móvil en contacto entre sí; o describiendo las interacciones químicas o físicas entre el soluto y la fase estacionaria. Consideremos brevemente cómo podríamos usar cada una de estas clasificaciones.

Podemos rastrear la historia de la cromatografía hasta el cambio de siglo cuando el botánico ruso Mikhail Tswett utilizó una columna llena de carbonato de calcio y una fase móvil de éter de petróleo para separar los pigmentos coloreados de los extractos de plantas. A medida que la muestra se movía a través de la columna, los pigmentos de la planta se separaron en bandas coloreadas individuales Después de efectuar la separación, el carbonato de calcio se retiró de la columna, se seccionó y se recuperaron los pigmentos. Tswett nombró a la técnica cromatografía, combinando las palabras griegas para “color” y “escribir”. Hubo poco interés en la técnica de Tswett hasta que Martin y Synge fueron pioneros en el desarrollo de una teoría de la cromatografía (ver Martin, A. J. P.; Synge, R. L. M. “A New Form of Chromatogram Emplays Two Liquid Phases”, Biochem. J. 1941, 35, 1358—1366). Martin y Synge fueron galardonados con el Premio Nobel de Química 1952 por esta obra.

Tipos de Fases Móviles y Fases Estacionarias

La fase móvil es un líquido o un gas, y la fase estacionaria es una película sólida o líquida recubierta sobre un sustrato sólido. A menudo nombramos técnicas cromatográficas enumerando el tipo de fase móvil seguida del tipo de fase estacionaria. En la cromatografía gas-líquido, por ejemplo, la fase móvil es un gas y la fase estacionaria es una película líquida recubierta sobre un sustrato sólido. Si el nombre de una técnica incluye solo una fase, como en la cromatografía de gases, es la fase móvil.

Contacto entre la fase móvil y la fase estacionaria

Existen dos métodos comunes para poner en contacto la fase móvil y la fase estacionaria. En cromatografía en columna empaquetamos la fase estacionaria en una columna estrecha y pasamos la fase móvil a través de la columna usando gravedad o aplicando presión. La fase estacionaria es una partícula sólida o una película líquida delgada recubierta sobre un material de relleno particulado sólido o sobre las paredes de la columna.

En la cromatografía plana, la fase estacionaria se recubre sobre una superficie plana, típicamente, una placa de vidrio, metal o plástico. Un extremo de la placa se coloca en un depósito que contiene la fase móvil, que se mueve a través de la fase estacionaria por acción capilar. En la cromatografía en papel, por ejemplo, el papel es la fase estacionaria.

Interacción entre el soluto y la fase estacionaria

La interacción entre el soluto y la fase estacionaria proporciona un tercer método para describir una separación (Figura\(\PageIndex{2}\)). En la cromatografía de adsorción, los solutos se separan en función de su capacidad para adsorberse a una fase estacionaria sólida. En la cromatografía de reparto, la fase estacionaria es una película líquida delgada sobre un soporte sólido. La separación ocurre porque existe una diferencia en el reparto de equilibrio de solutos entre la fase estacionaria y la fase móvil. Una fase estacionaria que consiste en un soporte sólido con grupos funcionales aniónicos (por ejemplo\(-\text{SO}_3^-\)) o catiónicos unidos covalentemente es la base para la cromatografía de intercambio iónico en la que los solutos iónicos son atraídos a la fase estacionaria por fuerzas electrostáticas.\(-\text{N(CH}_3)_3^+\) En la cromatografía de exclusión por tamaño la fase estacionaria es una partícula porosa o gel, con separación basada en el tamaño de los solutos. Los solutos más grandes son incapaces de penetrar tan profundamente en la fase estacionaria porosa y pasar más rápidamente a través de la columna.

Figura\(\PageIndex{2}\). Cuatro ejemplos de interacciones entre un soluto y la fase estacionaria: (a) adsorción sobre una superficie sólida, (b) partición en fase líquida, (c) intercambio iónico y (d) exclusión por tamaño. Para cada ejemplo, el soluto verde más pequeño se retiene más fuertemente que el soluto rojo más grande.

Hay otras interacciones que pueden servir como base de una separación. En la cromatografía de afinidad la interacción entre un antígeno y un anticuerpo, entre una enzima y un sustrato, o entre un receptor y un ligando forma la base de una separación.

Cromatografía de elución en columnas

De los dos métodos para poner en contacto la fase estacionaria y las fases móviles, el más importante es la cromatografía en columna. En esta sección desarrollamos una teoría general que podemos aplicar a cualquier forma de cromatografía en columna.

La Figura\(\PageIndex{3}\) proporciona una vista simple de un experimento de cromatografía en columna líquido-sólido. La muestra se introduce como una banda estrecha en la parte superior de la columna. Idealmente, el perfil de concentración inicial del soluto es rectangular (Figura\(\PageIndex{4}\) a). A medida que la muestra baja por la columna, los solutos comienzan a separarse (Figura\(\PageIndex{3}\) b, c) y las bandas individuales de solutos comienzan a ampliarse y desarrollar un perfil gaussiano (Figura\(\PageIndex{4}\) b, c). Si la fuerza de la interacción de cada soluto con la fase estacionaria es suficientemente diferente, entonces los solutos se separan en bandas individuales (Figura\(\PageIndex{3}\) d y Figura\(\PageIndex{4}\) d).

Figura\(\PageIndex{3}\). Avance de una separación cromatográfica en columna de una mezcla de dos componentes. En (a) la muestra se coloca en capas sobre la fase estacionaria. A medida que la fase móvil pasa a través de la columna, la muestra se separa en dos bandas de soluto (b—d). En (e) y (f), recogemos cada soluto a medida que eluye de la columna.

Figura\(\PageIndex{4}\). Una vista alternativa de la separación en la Figura\(\PageIndex{1}\) que muestra la concentración de cada soluto en función de la distancia a lo largo de la columna.

Podemos seguir el progreso de la separación recogiendo fracciones a medida que eluyen de la columna (Figura\(\PageIndex{3}\) e, f), o colocando un detector adecuado al final de la columna. Una gráfica de la respuesta del detector en función del tiempo de elución, o en función del volumen de la fase móvil, se conoce como cromatograma (Figura\(\PageIndex{5}\)), y consiste en un pico para cada soluto.

Figura\(\PageIndex{5}\). Cromatograma para la separación mostrado en la Figura\(\PageIndex{3}\) y Figura\(\PageIndex{4}\), mostrando la respuesta del detector en función del tiempo de elución.

Hay muchos detectores posibles que podemos usar para monitorear la separación. Secciones posteriores de este capítulo describen algunas de las más populares.