26.4: Optimización y Desempeño de Columna

El objetivo de una separación cromatográfica es tomar una muestra con más de un soluto y separar los solutos de tal manera que cada soluto eluya por sí mismo. Nuestra capacidad de separar dos solutos entre sí, para resolverlos, se ve afectada por una serie de variables; cómo podemos optimizar la separación de dos solutos, es el tema de esta sección.

Resolución de Columna

El objetivo de la cromatografía es separar una mezcla en una serie de picos cromatográficos, cada uno de los cuales constituye un solo componente de la mezcla. La resolución entre dos picos cromatográficos, R _AB, es una medida cuantitativa de su separación, y se define como

\[R_{A B}=\frac{t_{t, B}-t_{t,A}}{0.5\left(w_{B}+w_{A}\right)}=\frac{2 \Delta t_{r}}{w_{B}+w_{A}} \label{res1} \]

donde B es la elución posterior de los dos solutos. Como se muestra en la Figura\(\PageIndex{1}\), la separación de dos picos cromatográficos mejora con un incremento en R _AB. Si las áreas bajo los dos picos son idénticas, como es el caso en la Figura,\(\PageIndex{1}\) entonces una resolución de 1.50 corresponde a un solapamiento de solo 0.13% para los dos perfiles de elución. Debido a que la resolución es una medida cuantitativa del éxito de una separación, es una forma útil de determinar si un cambio en las condiciones experimentales conduce a una mejor separación.

Figura\(\PageIndex{1}\). Tres ejemplos que muestran la relación entre la resolución y la separación de una mezcla de dos componentes. El pico verde y el pico rojo son los perfiles de elución para los dos componentes. El pico cromatográfico, que es la suma de los dos perfiles de elución, se muestra mediante la línea negra continua.

Ejemplo\(\PageIndex{1}\)

En un análisis cromatográfico de aceite de limón un pico para limoneno tiene un tiempo de retención de 8.36 min con un ancho basal de 0.96 min. \(\gamma\)-Terpineno eluye a 9.54 min con un ancho basal de 0.64 min. ¿Cuál es la resolución entre los dos picos?

Solución

Usando la ecuación\ ref {res1} encontramos que la resolución es

\[R_{A B}=\frac{2 \Delta t_{r}}{w_{B}+w_{A}}=\frac{2(9.54 \text{ min}-8.36 \text{ min})}{0.64 \text{ min}+0.96 \text{ min}}=1.48 \nonumber \]

El efecto de los factores de retención y selectividad en la resolución

Ahora que hemos definido el factor de retención de solutos, la selectividad y la eficiencia de la columna, podemos considerar cómo afectan la resolución de dos picos de elución cercana. Debido a que los dos picos tienen tiempos de retención similares, es razonable suponer que sus anchos de pico son casi idénticos. Si el número de placas teóricas es el mismo para todos los solutos—no estrictamente cierto, pero no una mala suposición— entonces la relación t _r/w es una constante. Si dos solutos tienen tiempos de retención similares, entonces sus anchos de pico deben ser similares. La ecuación\ ref {res1}, por lo tanto, se convierte

\[R_{A B}=\frac{t_{r, B}-t_{r, A}}{0.5\left(w_{B}+w_{A}\right)} \approx \frac{t_{r, B}-t_{r, A}}{0.5\left(2 w_{B}\right)}=\frac{t_{r, B}-t_{r, A}}{w_{B}} \label{res2} \]

donde B es la elución posterior de los dos solutos. Resolver la ecuación 26.3.8 para w _B y sustituirla en Ecuación\ ref {res2} nos deja con el siguiente resultado.

\[R_{A B}=\frac{\sqrt{N_{B}}}{4} \times \frac{t_{r, B}-t_{r, A}}{t_{r, B}} \label{res3} \]

Reorganizar la ecuación 26.2.11 nos proporciona las siguientes ecuaciones para los tiempos de retención de los solutos A y B.

\[t_{r, A}=k_{A} t_{\mathrm{m}}+t_{\mathrm{m}} \label{res4} \]

\[t_{\mathrm{r}, B}=k_{B} t_{\mathrm{m}}+t_{\mathrm{m}} \label{res5} \]

Después de sustituir estas ecuaciones en la Ecuación\ ref {res3} y simplificarlas, tenemos

\[R_{A B}=\frac{\sqrt{N_{B}}}{4} \times \frac{k_{B}-k_{A}}{1+k_{B}} \label{ref6} \]

Finalmente, podemos eliminar el factor de retención del soluto A sustituyendo en la ecuación 26.2.12. Después de reorganizar, terminamos con la siguiente ecuación para la resolución entre los picos cromatográficos para los solutos A y B.

\[R_{A B}=\frac{\sqrt{N_{B}}}{4} \times \frac{\alpha-1}{\alpha} \times \frac{k_{B}}{1+k_{B}} \label{res7} \]

Aunque la Ecuación\ ref {res7} es útil para considerar cómo un cambio en N,\(\alpha\), o k afecta cualitativamente la resolución, lo que se adapta a nuestro propósito aquí, es menos útil para hacer predicciones cuantitativas precisas de resolución, particularmente para valores más pequeños de N y para valores mayores de R. Para predicciones más precisas usa la ecuación

\[R_{A B}=\frac{\sqrt{N}}{4} \times(\alpha-1) \times \frac{k_{B}}{1+k_{\mathrm{avg}}} \nonumber \]

donde k _avg es (k _A + k _B) /2. Para una derivación de esta ecuación y para una discusión más profunda de la resolución en cromatografía en columna, véase Foley, J. P. “Resolution Equings for Column Chromatography”, Analyst, 1991, 116, 1275-1279.

La ecuación\ ref {res7} contiene términos que corresponden a la eficiencia de la columna, la selectividad y el factor de retención de solutos. Podemos variar estos términos, de manera más o menos independiente, para mejorar la resolución y el tiempo de análisis. El primer término, que es una función del número de placas teóricas (para la Ecuación\ ref {res7}), explica el efecto de la eficiencia de la columna. El segundo término es una función\(\alpha\) y explica la influencia de la selectividad de la columna. Finalmente, el tercer término en ambas ecuaciones es una función de k _B y explica el efecto del factor de retención del soluto B. Una discusión sobre cómo podemos usar estos parámetros para mejorar la resolución es el tema del resto de esta sección.

El efecto de la resolución sobre el tiempo de retención

Además de la resolución, otro factor importante en la cromatografía es la cantidad de tiempo necesario para eluir un par de solutos, que podemos aproximar utilizando el tiempo de retención para el soluto B.

\[t_{r, B}=\frac{16 R_{AB}^{2} H}{u} \times\left(\frac{\alpha}{\alpha-1}\right)^{2} \times \frac{\left(1+k_{B}\right)^{3}}{k_{B}^{2}} \label{res8} \]

donde u es la velocidad de la fase móvil.

Variables que afectan el rendimiento de la columna

Uso del factor de retención para optimizar la resolución

Una de las formas más sencillas de mejorar la resolución es ajustar el factor de retención para el soluto B. Si todos los demás términos de la Ecuación\ ref {res7} permanecen constantes, un incremento en k _B mejorará la resolución. Como lo muestra la curva verde en la Figura 26.4.2 , sin embargo, la mejora es mayor si el valor inicial de k _B es pequeño. Una vez que k _B supera un valor de aproximadamente 10, un aumento adicional produce solo una mejora marginal en la resolución. Por ejemplo, si el valor original de k _B es 1, aumentar su valor a 10 da una mejora de 82% en la resolución; otro incremento a 15 proporciona una mejora neta en la resolución de sólo 87.5%.

Figura 26.4.2 . Efecto de k _B sobre la resolución para un par de solutos, R _AB, y el tiempo de retención para el soluto eluyente posterior, t _{r, B}. Los ejes y muestran la resolución y el tiempo de retención relativos a sus respectivos valores cuando k _B es 1.00.

Cualquier mejora en la resolución por aumentar el valor de k _B generalmente viene a costa de un tiempo de análisis más largo. La curva roja en la Figura 26.4.2 muestra el cambio relativo en el tiempo de retención para el soluto B en función de su factor de retención. Tenga en cuenta que el tiempo mínimo de retención es para k _B = 2. Aumentar k _B de 2 a 10, por ejemplo, aproximadamente duplica el tiempo de retención del soluto B.

La relación entre el factor de retención y el tiempo de análisis en la Figura {{template.index (ID:2)} funciona a nuestro favor si una separación produce una resolución aceptable con un k _B grande. En este caso podemos disminuir k _B con poca pérdida de resolución y con un tiempo de análisis significativamente más corto.

Para aumentar k _B sin cambiar la selectividad\(\alpha\), cualquier cambio en las condiciones cromatográficas debe dar como resultado un aumento general no selectivo en el factor de retención para ambos solutos. En cromatografía de gases, podemos lograr esto disminuyendo la temperatura de la columna. Debido a que la presión de vapor de un soluto es menor a temperaturas más bajas, pasa más tiempo en la fase estacionaria y tarda más en eluirse. En la cromatografía líquida, la forma más fácil de aumentar el factor de retención de un soluto es usar una fase móvil que sea un disolvente más débil. Cuando la fase móvil tiene una menor fuerza de solvente, los solutos pasan proporcionalmente más tiempo en la fase estacionaria y tardan más en eluirse.

Uso de la selectividad para optimizar la resolución

Un segundo enfoque para mejorar la resolución es ajustar la selectividad,\(\alpha\). De hecho, por\(\alpha \approx 1\) lo general no es posible mejorar la resolución ajustando el factor de retención de soluto, k _B, o la eficiencia de la columna, N. Un cambio en\(\alpha\) muchas veces tiene un efecto más dramático en la resolución que un cambio en k _B. Por ejemplo, cambiar\(\alpha\) de 1.1 a 1.5, mientras se mantienen constantes todos los demás términos, mejora la resolución en un 267%. En cromatografía de gases, ajustamos\(\alpha\) cambiando la fase estacionaria; en cromatografía líquida, cambiamos la composición de la fase móvil para ajustarla\(\alpha\).

Para cambiar\(\alpha\) necesitamos ajustar selectivamente los factores individuales de retención de solutos. La Figura 26.4.3 muestra una posible aproximación para la separación por cromatografía líquida de una mezcla de ácidos benzoicos sustituidos. Debido a que el tiempo de retención de la forma ácida débil de un compuesto y su forma de base débil son diferentes, su tiempo de retención variará con el pH de la fase móvil, como se muestra en la Figura 26.4.3 a. las intersecciones de las curvas en la Figura {{template.index (ID:3)} a muestran valores de pH donde dos solutos eluyen conjuntamente. Por ejemplo, a un pH de 3.8, el ácido tereftálico y el ácido p-hidroxibenzoico eluyen como un único pico cromatográfico.

Figura 26.4.3 . Ejemplo que muestra cómo el pH de la fase móvil en cromatografía líquida afecta la selectividad: (a) tiempos de retención para cuatro ácidos benzoicos sustituidos en función del pH de la fase móvil; (b) valores alfa para tres pares de solutos que son difíciles de separar. Ver texto para más detalles. La fase móvil es un tampón de ácido acético/acetato de sodio y la fase estacionaria es un hidrocarburo no polar. Datos de Harvey, D. T.; Byerly, S.; Bowman, A.; Tomlin, J. “Optimización de separaciones por HPLC y GC usando superficies de respuesta”, J. Chem. Educ. 1991, 68, 162—168.

La figura 26.4.3 a muestra que hay muchos valores de pH donde es posible cierta separación. Para encontrar la separación óptima, trazamos una para cada par de solutos. Las curvas roja, verde y naranja en la Figura 26.4.3 b muestran la variación en a con pH para los tres pares de solutos que son más difíciles de separar (para todos los demás pares de solutos,\(\alpha\) > 2 en todos los niveles de pH). El sombreado azul muestra ventanas de valores de pH en las que al menos es posible una separación parcial, esta cifra a veces se denomina diagrama de ventanas, y el punto más alto en cada ventana da el pH óptimo dentro de ese rango. La mejor separación general es el punto más alto en cualquier ventana, que, para este ejemplo, es un pH de 3.5. Debido a que el tiempo de análisis a este pH es superior a 40 min (Figura 26.4.3 a), elegir un pH entre 4.1—4.4 podría producir una separación aceptable con un tiempo de análisis mucho más corto.

Usemos ácido benzoico, C ₆ H ₅ COOH, para explicar por qué el pH puede afectar el tiempo de retención de un soluto. La separación utiliza una fase móvil acuosa y una fase estacionaria no polar. A pH más bajos, el ácido benzoico se encuentra predominantemente en su forma de ácido débil, C ₆ H ₅ COOH, y se divide fácilmente en la fase estacionaria no polar. A pH más básicos, sin embargo, el ácido benzoico se encuentra en su forma de base débil, C ₆ H ₅ COO ^—. Debido a que ahora lleva una carga, su solubilidad en la fase móvil aumenta y su solubilidad en la fase estacionaria no polar disminuye. Como resultado, pasa más tiempo en la fase móvil y tiene un tiempo de retención más corto.

Aunque la forma habitual de ajustar el pH es cambiar la concentración de agentes amortiguadores, también es posible ajustar el pH cambiando la temperatura de la columna porque el valor p K a de _un soluto es dependiente del pH; para una revisión, ver Gagliardi, L. G.; Tascon, M.; Castells, C. B. “Efecto de Temperatura en Equilibrios Ácido-Base en Técnicas de Separación: Una Revisión,” Anal. Chim. Acta, 2015, 889, 35—57.

Uso de la eficiencia de columna para optimizar la resolución

Un tercer enfoque para mejorar la resolución es ajustar la eficiencia de la columna aumentando el número de placas teóricas, N. Si tenemos valores para k _B y\(\alpha\), entonces podemos usar la Ecuación\ ref {res7} para calcular el número de placas teóricas para cualquier resolución. Table 26.4.1 proporciona algunos valores representativos. Por ejemplo, si\(\alpha\) = 1.05 y k _B = 2.0, una resolución de 1.25 requiere aproximadamente 24 800 placas teóricas. Si nuestra columna proporciona solo 12 400 placas, la mitad de lo que se necesita, entonces no es posible una separación. ¿Cómo podemos duplicar el número de planchas teóricas? La forma más fácil es duplicar la longitud de la columna, aunque esto también duplica el tiempo de análisis. Un mejor enfoque es cortar la altura de una placa teórica, H, a la mitad, proporcionando la resolución deseada sin cambiar el tiempo de análisis. Aún mejor, si podemos disminuir H en más de 50%, puede ser posible lograr la resolución deseada con un tiempo de análisis aún más corto al disminuir también k _B o\(\alpha\).

Tabla 26.4.1 . Número mínimo de placas teóricas para lograr la resolución deseada para valores seleccionados de k _B y\(\alpha\)

	R AB = 1.00		R AB = 1.25		R AB = 1.50
k B	\(\alpha = 1.05\)	\(\alpha = 1.10\)	\(\alpha = 1.05\)	\(\alpha = 1.10\)	\(\alpha = 1.05\)	\(\alpha = 1.10\)
0.5	63500	17400	99200	27200	143000	39200
1.0	28200	7740	44100	12100	63500	17400
1.5	19600	5380	30600	8400	44100	12100
2.0	15900	4360	24800	6810	35700	9800
3.0	12500	3440	19600	5380	28200	7740
5.0	10200	2790	15900	4360	22900	6270
10.0	8540	2340	13300	3660	19200	5270

El problema general de la elución

Ajustar el factor de retención para mejorar la resolución entre un par de solutos puede conducir a tiempos de retención inaceptablemente largos para otros solutos. Por ejemplo, supongamos que necesitamos analizar una mezcla de cuatro componentes con resolución basal y con un tiempo de ejecución inferior a 20 min. Nuestra elección inicial de condiciones da el cromatograma en la Figura 26.4.4 a. Aunque separamos con éxito los componentes 3 y 4 en 15 min, fallamos en separar los componentes 1 y 2. Ajustar las condiciones para mejorar la resolución de los dos primeros componentes al aumentar k ₂ proporciona una buena separación de los cuatro componentes, pero el tiempo de ejecución es demasiado largo (Figura 26.4.4 b). Este problema de encontrar un solo conjunto de condiciones de operación aceptables se conoce como el problema general de elución.

Figura 26.4.4 . Ejemplo que muestra el problema general de elución en cromatografía. Ver texto para más detalles.

Una solución al problema general de elución es hacer ajustes incrementales al factor de retención a medida que se produce la separación. Al inicio de la separación establecemos las condiciones cromatográficas iniciales para optimizar la resolución de solutos de elución temprana. A medida que avanza la separación, ajustamos las condiciones cromatográficas para disminuir el factor de retención y, por tanto, disminuir el tiempo de retención, para cada uno de los solutos que eluyen posteriormente (Figura 26.4.4 c). En cromatografía de gases esto se logra mediante programación de temperatura. La temperatura inicial de la columna se selecciona de tal manera que los primeros solutos a eluir se resuelven completamente. Luego se aumenta la temperatura, ya sea de forma continua o por etapas, para desprender los componentes que eluyen posteriormente con una resolución aceptable y un tiempo de análisis razonable. En cromatografía líquida se obtiene el mismo efecto aumentando la fuerza de elución del disolvente. Esto se conoce como elución en gradiente. Tendremos más que decir sobre cada uno de estos en secciones posteriores de este capítulo.