26.3: Ampliamiento de Zona y Eficiencia de Columna
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Supongamos que inyectamos una muestra que tiene un solo componente. Por el momento inyectamos la muestra es una banda estrecha de ancho finito. A medida que la muestra pasa por la columna, el ancho de esta banda aumenta continuamente en un proceso que llamamos ensanchamiento de banda. La eficiencia de la columna es una medida cuantitativa del grado de ampliación de banda.
La forma de los picos cromatográficos
Cuando inyectamos una muestra en una columna, tiene un perfil de concentración uniforme o rectangular con respecto a la distancia hacia abajo de la columna. A medida que la muestra pasa a través de la columna, las partículas individuales de soluto entran y salen de la fase estacionaria, permaneciendo en su lugar cuando se encuentran en la fase estacionaria y bajando por la columna cuando se encuentran en la fase móvil. Debido a que algunas partículas de soluto, en promedio, pasarán más tiempo en la fase móvil y algunas, en promedio, pasarán más tiempo en la fase estacionaria, la banda rectangular original aumenta de ancho y adquiere forma gaussiana, como vemos en la Figura\(\PageIndex{1}\).
Nuestro tratamiento de la cromatografía en esta sección asume que un soluto eluye como un pico gaussiano simétrico, como el que se muestra en la Figura\(\PageIndex{1}\). Este comportamiento ideal ocurre cuando el coeficiente de partición del soluto, K D
\[K_{\mathrm{D}}=\frac{[S_\text{s}]}{\left[S_\text{m}\right]} \label{shape1} \]
es lo mismo para todas las concentraciones de soluto. Si este no es el caso, entonces el pico cromatográfico tiene una forma de pico asimétrica similar a las que se muestran en la Figura\(\PageIndex{2}\). El pico cromatográfico en la Figura a es\(\PageIndex{2}\) un ejemplo de pico de cola, que ocurre cuando algunos sitios en la fase estacionaria retienen el soluto más fuertemente que otros sitios. La Figura\(\PageIndex{2}\) b, que es un ejemplo de frente de pico con mayor frecuencia es el resultado de sobrecargar la columna con muestra.
Como se muestra en la Figura\(\PageIndex{2}\) a, podemos reportar una asimetría de pico dibujando una línea horizontal al 10% de la altura máxima del pico y midiendo la distancia desde cada lado del pico hasta una línea trazada verticalmente a través del máximo del pico. El factor de asimetría, T, se define como
\[T=\frac{b}{a} \label{shape2} \]
Métodos para describir la eficiencia de la columna
En su modelo teórico original de cromatografía, Martin y Synge dividieron la columna cromatográfica en secciones discretas, a las que llamaron placas teóricas. Dentro de cada placa teórica existe un equilibrio entre el soluto presente en la fase estacionaria y el soluto presente en la fase móvil [Martin, A. J. P.; Synge, R. L. M. Biochem. J. 1941, 35, 1358—1366]. Describieron la eficiencia de la columna en términos del número de placas teóricas, N,
\[N=\frac{L}{H} \label{eff1} \]
donde L es la longitud de la columna y H es la altura de una placa teórica. Para cualquier columna dada, la eficiencia de la columna mejora —y los picos cromatográficos se vuelven más estrechos— cuando hay más placas teóricas.
Si asumimos que un pico cromatográfico tiene un perfil gaussiano, entonces la extensión del ensanchamiento de banda viene dada por la varianza o desviación estándar del pico. La altura de una placa teórica es la varianza del pico por unidad de longitud de la columna
\[H=\frac{\sigma^{2}}{L} \label{eff2} \]
donde la desviación estándar,\(\sigma\), tiene unidades de distancia. Debido a que los tiempos de retención y los anchos de pico generalmente se miden en segundos o minutos, es más conveniente expresar la desviación estándar en unidades de tiempo\(\tau\), dividiendo\(\sigma\) por la velocidad lineal promedio del soluto\(\overline{u}\), lo que equivale a dividir la distancia que recorre, L, por su tiempo de retención, t r.
\[\tau=\frac{\sigma}{\overline{u}}=\frac{\sigma t_{r}}{L} \label{eff3} \]
Para una forma de pico gaussiano, el ancho en la línea base, w, es cuatro veces su desviación estándar,\(\tau\).
\[w = 4 \tau \label{eff4} \]
Combinando la ecuación\ ref {eff2}, la ecuación\ ref {eff3} y la ecuación\ ref {eff4} define la altura de una placa teórica en términos de los parámetros cromatográficos fácilmente medidos t r y w.
\[H=\frac{L w^{2}}{16 t_\text{r}^{2}} \label{eff5} \]
La ecuación de peinado\ ref {eff5} y la ecuación\ ref {eff1} da el número de placas teóricas.
\[N=16 \frac{t_{\mathrm{r}}^{2}}{w^{2}}=16\left(\frac{t_{\mathrm{r}}}{w}\right)^{2} \label{eff6} \]
Un análisis cromatográfico para el pesticida clorado Dieldrin da un pico con un tiempo de retención de 8.68 min y un ancho basal de 0.29 min. ¿Calcular el número de planchas teóricas? Dado que la columna tiene 2.0 m de largo, ¿cuál es la altura de una placa teórica en mm?
Solución
Usando la ecuación\ ref {eff6}, el número de placas teóricas es
\[N=16 \frac{t_{\mathrm{r}}^{2}}{w^{2}}=16 \times \frac{(8.68 \text{ min})^{2}}{(0.29 \text{ min})^{2}}=14300 \text{ plates} \nonumber \]
Resolviendo la ecuación\ ref {eff1} para H da la altura promedio de una placa teórica como
\[H=\frac{L}{N}=\frac{2.00 \text{ m}}{14300 \text{ plates}} \times \frac{1000 \text{ mm}}{\mathrm{m}}=0.14 \text{ mm} / \mathrm{plate} \nonumber \]
Es importante recordar que una placa teórica es un constructo artificial y que una columna cromatográfica no contiene placas físicas. De hecho, el número de placas teóricas depende tanto de las propiedades de la columna como del soluto. Como resultado, el número de placas teóricas para una columna puede variar de soluto a soluto.
El número de placas teóricas para una forma de pico asimétrica es aproximadamente
\[N \approx \frac{41.7 \times \frac{t_{r}^{2}}{\left(w_{0.1}\right)^{2}}}{T+1.25}=\frac{41.7 \times \frac{t_{r}^{2}}{(a+b)^{2}}}{T+1.25} \label{eff7} \]
donde w 0.1 es el ancho al 10% de la altura del pico [Foley, J. P.; Dorsey, J. G. Anal. Chem. 1983, 55, 730—737].
Los picos asimétricos tienen menos placas teóricas, y cuanto más asimétrico es el pico, menor es el número de placas teóricas. Por ejemplo, la siguiente tabla da valores para N para un soluto eluyendo con un tiempo de retención de 10.0 min y un ancho de pico de 1.00 min.
| b | a | T | N |
|---|---|---|---|
| 0.5 | 0.5 | 1.00 | 1850 |
| 0.6 | 0.4 | 1.50 | 1520 |
| 0.7 | 0.3 | 2.33 | 1160 |
| 0.8 | 0.2 | 4.00 | 790 |
Variables cinéticas que afectan la ampliación de zonas
Otro enfoque para entender el ensanchamiento a medida que una banda de soluto pasa a través de una columna es considerar los factores que afectan la velocidad a la que un soluto se mueve a través de la columna y cómo eso se ve afectado por la velocidad con la que la fase móvil se mueve a través de la columna. Consideraremos un enfoque que considera cuatro contribuciones: variaciones en la longitud de trayectoria, difusión longitudinal, transferencia de masa en la fase estacionaria y transferencia de masa en la fase móvil.
Varias trayectorias: variaciones en la longitud de la trayectoria
A medida que las moléculas de soluto pasan por la columna recorren caminos que difieren en longitud. Debido a esta diferencia en la longitud de la ruta, dos moléculas de soluto que ingresan a la columna al mismo tiempo saldrán de la columna en diferentes momentos. El resultado, como se muestra en la Figura\(\PageIndex{3}\), es una ampliación del perfil del soluto en la columna. La contribución de múltiples caminos a la altura de una placa teórica, H p, es
\[H_{p}=2 \lambda d_{p} \label{van1} \]
donde d p es el diámetro promedio del material particulado de empaque y\(\lambda\) es una constante que da cuenta de la consistencia del empaque. Un rango más pequeño de tamaños de partícula y un empaque más consistente producen un valor más pequeño para\(\lambda\). Para una columna sin material de empaque, H p es cero y no hay contribución al ensanchamiento de banda desde múltiples trayectorias.
Un empaquetamiento inconsistente crea canales que permiten que algunas moléculas de soluto viajen rápidamente a través de la columna. También puede crear bolsas que atrapan temporalmente algunas moléculas de soluto, ralentizando su progreso a través de la columna. Un empaque más uniforme minimiza estos problemas.
Difusión longitudinal
La segunda contribución al ensanchamiento de banda es el resultado de la difusión longitudinal del soluto en la fase móvil. Las moléculas de soluto están en constante movimiento, difundiéndose desde regiones de mayor concentración de soluto a regiones donde la concentración de soluto es menor. El resultado es un incremento en el ancho de banda del soluto (Figura\(\PageIndex{4}\)). La contribución de la difusión longitudinal a la altura de una placa teórica, H d, es
\[H_{d}=\frac{2 \gamma D_{m}}{u} \label{van2} \]
donde D m es el coeficiente de difusión del soluto en la fase móvil, u es la velocidad de la fase móvil y\(\gamma\) es una constante relacionada con la eficiencia del empaquetamiento de la columna. Obsérvese que el efecto de H d sobre el ensanchamiento de banda es inversamente proporcional a la velocidad de la fase móvil: una mayor velocidad proporciona menos tiempo para la difusión longitudinal. Debido a que el coeficiente de difusión de un soluto es mayor en la fase gaseosa que en una fase líquida, la difusión longitudinal es un problema más grave en la cromatografía de gases.
Transferencia Masiva
A medida que el soluto pasa por la columna se mueve entre la fase móvil y la fase estacionaria. A este movimiento lo llamamos transferencia de masa entre fases. Como se muestra en la Figura\(\PageIndex{5}\), el ensanchamiento de banda ocurre si el movimiento del soluto dentro de la fase móvil o dentro de la fase estacionaria no es lo suficientemente rápido como para mantener un equilibrio en su concentración entre las dos fases. En promedio, una molécula de soluto en la fase móvil baja por la columna antes de pasar a la fase estacionaria. Una molécula de soluto en la fase estacionaria, por otro lado, tarda más de lo esperado en volver a la fase móvil. Las contribuciones de transferencia de masa en la fase estacionaria, H s, y transferencia de masa en la fase móvil, H m, están dadas por las siguientes ecuaciones
\[H_{s}=\frac{q k d_{f}^{2}}{(1+k)^{2} D_{s}} u \label{van3} \]
\[H_{m}=\frac{f n\left(d_{p}^{2}, d_{c}^{2}\right)}{D_{m}} u \label{van4} \]
donde d f es el espesor de la fase estacionaria, d c es el diámetro de la columna, D s y D m son los coeficientes de difusión para el soluto en la fase estacionaria y la fase móvil, k es el factor de retención del soluto, y q es una constante relacionada con el material de relleno de la columna. Aunque no se conoce la forma exacta de H m, es una función del tamaño de partícula y el diámetro de la columna. Tenga en cuenta que el efecto de H s y H m sobre el ensanchamiento de banda es directamente proporcional a la velocidad de la fase móvil porque una velocidad menor proporciona más tiempo para la transferencia de masa.
La abreviatura fn en Ecuación\ ref {van4} significa “es una función de”.
Poniéndolo todo junto
La altura de una placa teórica es una suma de las contribuciones de cada uno de los términos que afectan el ensanchamiento de banda.
\[H=H_{p}+H_{d}+H_{s}+H_{m} \label{van5} \]
Una forma alternativa de esta ecuación es la ecuación de van Deemter
\[H=A+\frac{B}{u}+C u \label{van6} \]
que enfatiza la importancia de la velocidad de la fase móvil. En la ecuación de van Deemter, A da cuenta de la contribución de múltiples caminos (H p), B/u representa la contribución de la difusión longitudinal (H d), y Cu representa la contribución combinada de la transferencia de masa en la fase estacionaria y en la fase móvil (H s y H m).
Existe cierto desacuerdo sobre la mejor ecuación para describir la relación entre la altura de la placa y la velocidad de la fase móvil [Hawkes, S. J. J. Chem. Educ. 1983, 60, 393—398]. Además de la ecuación de van Deemter, otras ecuaciones incluyen
\[H=\frac{B}{u}+\left(C_s+C_{m}\right) u \label{van7} \]
donde C s y C m son los términos de transferencia de masa para la fase estacionaria y la fase móvil y
\[H=A u^{1 / 3}+\frac{B}{u}+C u \label{van8} \]
Las tres ecuaciones, y otras, han sido utilizadas para caracterizar sistemas cromatográficos, sin que una sola ecuación proporcione la mejor explicación en cada caso [Kennedy, R. T.; Jorgenson, J. W. Anal. Chem. 1989, 61, 1128—1135].
Para aumentar el número de placas teóricas sin aumentar la longitud de la columna, necesitamos disminuir uno o más de los términos en la Ecuación\ ref {van5}. La forma más fácil de disminuir H es ajustar la velocidad de la fase móvil. Para velocidades de fase móvil más pequeñas, la eficiencia de la columna está limitada por la difusión longitudinal, y para velocidades de fase móviles más altas la eficiencia está limitada por los dos términos de transferencia de masa. Como se muestra en la Figura 26.3.6 —que utiliza la ecuación van Deemter— la velocidad óptima de fase móvil es la mínima en una gráfica de H en función de u.
Los parámetros restantes que afectan a los términos de la Ecuación\ ref {van5} son funciones de las propiedades de la columna y sugieren otros posibles enfoques para mejorar la eficiencia de la columna. Por ejemplo, tanto H p como H m son una función del tamaño de las partículas utilizadas para empaquetar la columna. La disminución del tamaño de partícula, por lo tanto, es otro método útil para mejorar la eficiencia.
Para una discusión más detallada de las formas de evaluar la calidad de una columna, véase Desmet, G.; Caooter, D.; Broeckhaven, K. “Métodos de Representación de Datos Gráficos para Evaluar la Calidad de Columnas LC”, Anal. Chem. 2015, 87, 8593—8602.
Quizás el avance más importante en las columnas de cromatografía es el desarrollo de columnas tubulares abiertas o capilares. Estas columnas tienen diámetros muy pequeños (d c ≈ 50—500 μm) y no contienen material de empaque (d p = 0). En cambio, la pared interior de la columna capilar está recubierta con una película delgada de la fase estacionaria. La altura de placa se reduce porque la contribución a H de H p (Ecuación\ ref {van1}) desaparece y la contribución de H m (Ecuación\ ref {van4}) se vuelve más pequeña. Debido a que la columna no contiene ningún material de relleno sólido, se necesita menos presión para mover la fase móvil a través de la columna, lo que permite columnas más largas. La combinación de una columna más larga y una altura menor para una placa teórica aumenta aproximadamente el número de placas teóricas\(100 \times\). Las columnas capilares no están exentas de desventajas. Debido a que son mucho más estrechas que las columnas empaquetadas, requieren una cantidad significativamente menor de muestra, lo que puede ser difícil de inyectar de manera reproducible. Otro enfoque para mejorar la resolución es utilizar películas delgadas de fase estacionaria, lo que disminuye la contribución a H de H s (Ecuación\ ref {van3}).
Cuanto más pequeñas son las partículas, más presión se necesita para empujar la fase móvil a través de la columna. Como resultado, para cualquier forma de cromatografía existe un límite práctico para el tamaño de partícula.