1.6: Difracción experimental
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Independientemente de las enormes mejoras que se han producido para la generación de rayos X, las técnicas utilizadas para medir las intensidades y ángulos de los patrones de difracción han evolucionado con el tiempo. En el primer experimento de difracción, Friedrich y Knipping (1912) utilizaron una película sensible a los rayos X, pero incluso en el mismo año, Bragg utilizó una cámara de ionización montada sobre un brazo giratorio que, en general, podría determinar con mayor precisión los ángulos e intensidades. Sin embargo, la técnica cinematográfica tuvo la ventaja de poder recolectar muchos haces difractados al mismo tiempo, y así durante los primeros años de Cristalografía estructural (de 1920 a 1970) se hizo un uso extensivo de los métodos fotográficos. Entre ellas cabe destacar las siguientes técnicas: Laue, Weissenberg, precesión y oscilación.
Desde mediados de la década de 1970, los métodos fotográficos han sido reemplazados gradualmente por goniómetros acoplados a detectores puntuales que posteriormente han sido reemplazados por detectores de área.
El método Laue
Para sus primeros experimentos, Max von Laue (1879-1960 (Premio Nobel de Física en 1914) utilizó radiación continua (con todas las longitudes de onda posibles) para impactar sobre un cristal estacionario. Con este procedimiento el cristal genera un conjunto de haces difractados que muestran la simetría interna del cristal. En estas circunstancias, y tomando en cuenta la Ley de Bragg, las constantes experimentales son el espaciamiento interplanar d y la posición cristalina referida al haz incidente. Las variables son la longitud de onda λ y el número entero n:
n λ = 2 d hkl sin θ nh, nk, nl
Así, para el mismo espaciado interplanar d, el patrón de difracción contendrá los haces difractados correspondientes al primer orden de difracción (n = 1) de una cierta longitud de onda, el segundo orden ( n = 2) de la mitad de la longitud de onda (λ /2), el tercer orden (n = 3) con longitud de onda λ /3, etc. Por lo tanto, el diagrama de Laue es simplemente una proyección estereográfica del cristal. Consulta también la simulación Java que se ofrece a través de este enlace.
Diagrama Laue de un cristal
Existen dos geometrías diferentes en el método Laue, dependiendo de la posición del cristal con respecto a la placa fotográfica: transmisión o reflexión:
Izquierda: El método Laue en modo de transmisión
Derecha: El método Laue en modo reflexión
El método de Weissenberg
El método de Weissenberg se basa en una cámara con el mismo nombre, desarrollada en 1924 por el científico austriaco Karl Weissenberg (1893-1976). Para comprender la contribución de Weissenberg a la cristalografía de rayos X se deben leer los dos siguientes artículos que hace algunos años se ofrecieron a la Sociedad Británica de Reología: “La influencia de Weissenberg en la Cristalografía” (por H. Lipson) (use este enlace en caso de problemas) y “Karl Weissenberg y el desarrollo de la cristalografía de rayos X" (por M.J. Buerger).
La cámara consiste en un cilindro metálico que contiene una película sensible a los rayos X. El cristal se monta sobre un eje (coaxial con el cilindro) que gira. Según el modelo de Ewald, los puntos recíprocos cruzarán la superficie de la esfera de Ewald y se producirán haces difractados.
Los haces difractados generan puntos negros en la película fotográfica, que al ser retirados del cilindro metálico, aparecen como se muestra a continuación.
Izquierda: Esquema y ejemplo de una cámara Weissenberg. Este tipo de cámara se utilizó en laboratorios cristalográficos hasta alrededor de 1975.
Derecha: Cámara desarrollada por K. Weissenberg en 1924
Se pueden obtener fácilmente dos tipos de diagramas de difracción con las cámaras Weissenberg, dependiendo de la cantidad de rotación del cristal: diagramas de oscilación (rotación de aprox. +/-20 grados) o diagramas de rotación completa (360 grados) respectivamente. Se utilizan diagramas de oscilación para centrar el cristal, es decir, para asegurar que la rotación del eje coincida exactamente con un eje directo, lo que equivale a decir que los planos recíprocos (que por construcción geométrica son perpendiculares a un eje directo) generan líneas de manchas en la película fotográfica. Una vez logrado el centrado, se utilizan los diagramas de rotación completa para evaluar el eje directo del cristal, que coincide con el espaciado entre las líneas de puntos en el diagrama.
Esquema que explica la producción de un diagrama de Weissenberg de la variedad de rotación u oscilación. Cuando los puntos recíprocos, pertenecientes al mismo plano recíproco, tocan la superficie de la esfera de Ewald, producen haces difractados dispuestos en conos.
Como se muestra en el diagrama anterior, cada línea horizontal de puntos representa un plano recíproco perpendicular al eje de rotación tal como se proyecta sobre la placa fotográfica. La figura de la izquierda muestra la apariencia real de un diagrama de Weissenberg de este tipo, rotación-oscilación.
Como se explica a continuación, la distancia entre las líneas puntuales horizontales proporciona información sobre el período de repetición del cristal en la dirección vertical de la película.
Estos diagramas también se utilizaron para alinear cristales montados... Esta técnica requiere que el eje de rotación del cristal sea coincidente con un eje de su celosía directa, de manera que los planos recíprocos se recojan como líneas de puntos como se muestra a la izquierda.
El cristal debe montarse de tal manera que el eje de rotación coincida con un eje directo de la celda unitaria. Así, por definición de la celosía recíproca, habrá planos recíprocos perpendiculares a ese eje. Los puntos recíprocos (que se encuentran sobre estos planos recíprocos) giran cuando el cristal gira y (después de pasar por la esfera de Ewald) producen haces difractados que se disponen en conos, tocan la película cilíndrica y aparecen como puntos alineados (fotografía a la izquierda).
Parece obvio que estos diagramas proporcionan inmediatamente información sobre el periodo de repetición de la celosía directa en la dirección perpendicular a las líneas horizontales (planos recíprocos). Sin embargo, esos planos recíprocos (matrices bidimensionales de puntos recíprocos) se representan como proyecciones (una dimensión) sobre la película y por lo tanto es de esperar una fuerte superposición de puntos.
El problema con la superposición de puntos fue resuelto por Weissenberg agregando un mecanismo de traslación a la cámara, de tal manera que el cilindro que contiene la película pudiera moverse en un modo “de ida y vuelta” (en la dirección paralela al eje de rotación) acoplado con la rotación del cristal. Al mismo tiempo, introdujo dos cilindros internos (como se muestra en la figura de la izquierda, y también a continuación). De esta manera, sólo uno de los conos difractados (los de una capa recíproca) se “filtra” y por lo tanto se permite que llegue a la película fotográfica. Así, un solo plano recíproco (una matriz bidimensional de puntos recíprocos) se distribuye sobre la superficie de la película (dos dimensiones) y por lo tanto se evita el efecto de superposición.
Sin embargo, como consecuencia de la traslación de ida y vuelta de la cámara durante la rotación del cristal, se origina una deformación en la distribución de los puntos (intensidades de difracción)
A continuación se muestra la apariencia de dicho diagrama, que produce una deformación geométrica del plano recíproco recogido. Teniendo en cuenta esta deformación, se puede identificar fácilmente cada punto del plano recíproco seleccionado y medir su intensidad. Para seleccionar los planos recíprocos restantes solo hay que desplazar los cilindros internos y recoger sus correspondientes haces difractados (dispuestos en conos).
Izquierda: Detalles de la cámara Weissenberg utilizada para recoger un cono de haces difractados. Dos cilindros internos que muestran una hendidura, a través de la cual se permite que un cono de haces difractados llegue a la película fotográfica. El cilindro exterior, que contiene la película, se mueve de un lado a otro mientras el cristal gira, y así las manchas que en el tipo de diagrama anterior estaban en una línea (ver arriba) ahora se distribuyen en la superficie de la película (ver la figura de la derecha).
Derecha: Diagrama de Weissenberg que muestra el plano recíproco de índices hk2 del metaborado de cobre.
El método de precesión
El método de precesión fue desarrollado por Martin J. Buerger (1903-1986) a principios de la década de 1940 como una alternativa muy inteligente para recolectar intensidades difractadas sin distorsionar la geometría de los planos recíprocos.
Al igual que en la técnica de Weissenberg, la metodología de precesión también se basa en un cristal en movimiento, pero aquí el cristal se mueve (y también lo hace la red recíproca acoplada) como lo hacen los planetas, y de ahí su nombre. En este caso la película se coloca sobre un casete plano que se mueve siguiendo los movimientos del cristal.
En el método de precesión el cristal tiene que orientarse de manera que el plano recíproco a recoger sea perpendicular al haz directo de los rayos X, es decir, un eje directo coincide con la dirección de los rayos X incidentes.
Dos vistas esquemáticas que muestran el principio en el que se basa la cámara de precesión. μ es el ángulo de precesión alrededor del cual se mueven el plano recíproco y la película fotográfica. Durante este movimiento el plano recíproco y la película se mantienen siempre paralelos.
La cámara diseñada para este propósito y la aparición de un diagrama de precesión que muestra el patrón de difracción de un cristal inorgánico se muestran en las siguientes figuras.
Izquierda: Esquema y apariencia de una cámara de precesión
Derecha: Diagrama de precesión de una perovskita que muestra simetría cúbica
Los diagramas de precesión son mucho más sencillos de interpretar que los de Weissenberg, ya que muestran los planos recíprocos sin distorsión alguna. Muestran un solo plano recíproco en una placa fotográfica (imagen de arriba) cuando se coloca una hendidura circular entre el cristal y la película fotográfica. Como en el caso de los diagramas de Weissenberg, podemos medir fácilmente distancias e intensidades de difracción. Sin embargo, con estos diagramas es mucho más fácil observar la simetría del espacio recíproco.
La única desventaja del método de precesión es una consecuencia de la película, que es plana en lugar de cilíndrica, y por lo tanto el ángulo sólido explorado es menor que en el caso de Weissenberg.
El método de precesión se ha utilizado con éxito durante muchos años, incluso para cristales proteicos:
Izquierda: Diagrama de precesión de un cristal de lisozima. Se puede distinguir fácilmente un eje de simetría cuádruple perpendicular al diagrama. Según las relaciones entre celosías directas y recíprocas, si los ejes de la celda unitaria son grandes (como en este caso), la separación entre puntos recíprocos es pequeña.
Derecha: Diagrama de precesión de un compuesto orgánico simple, mostrando simetría mm (dos planos especulares perpendiculares al diagrama). Obsérvese que las distancias entre puntos recíprocos es mucho mayor (ejes celulares unitarios directos más pequeños) que en el caso de las proteínas (ver la figura de la izquierda).
El método de oscilación
Originalmente, se utilizaron con mucho éxito los métodos de rotación del cristal con un amplio ángulo de rotación. Sin embargo, cuando se aplicó a cristales con células directas más grandes (es decir, células recíprocas pequeñas), el tiempo de recolección aumentó. Por lo tanto, estos métodos fueron reemplazados por métodos que utilizan pequeños ángulos de oscilación, permitiendo recolectar múltiples partes de diferentes planos recíprocos a la vez. Recolectar este tipo de diagramas en diferentes posiciones iniciales del cristal es suficiente para obtener suficientes datos en un tiempo razonable. La geometría de la colección se describe en las figuras que se muestran a continuación. Hoy en día, con generadores de ánodo rotativos, sincrotrones y detectores de área (placa de imagen o CCD, ver abajo), este es el método ampliamente utilizado, especialmente para las proteínas.
Esquema de las condiciones geométricas para la difracción en el método de oscilación. El cristal, y por lo tanto su retícula recíproca, oscilan en un pequeño ángulo alrededor de un eje (perpendicular al plano de la figura) que pasa por el centro. En la figura de la derecha, el área recíproca que pasa por condiciones de difracción, dentro de la esfera de Ewald (con radio 2.sin 90/λ), se denota en amarillo. La resolución máxima que se puede obtener en el experimento viene dada por 2.sen θ max /λ).
Cuando la red recíproca se hace oscilar en un pequeño ángulo alrededor del eje de rotación, pequeñas áreas de diferentes planos recíprocos cruzarán la superficie de la esfera de Ewald, alcanzando la condición de difracción. Así, la pantalla del detector mostrará puntos de difracción de los diferentes planos recíprocos formando pequeños “lunes” en el diagrama (figura a la derecha). Una “lune” es una figura plana delimitada por dos arcos circulares de radios desiguales, es decir, una media luna.
Goniómetros de cuatro círculos
La introducción de las computadoras digitales a fines de la década de 1970 condujo al diseño de los llamados difractómetros automáticos de cuatro círculos. Estos goniómetros, con una mecánica muy precisa y mediante tres ejes de rotación, permiten llevar muestras de cristal a cualquier orientación en el espacio, cumpliendo con los requisitos de Ewald para producir difracción. Una vez orientado el cristal, se coloca un cuarto eje de rotación, que soporta el detector electrónico, en la posición correcta para recoger el haz difractado. Todos estos movimientos se pueden programar en modo automático, con mínima intervención del operador.
Dos geometrías goniométricas diferentes se han utilizado con mucho éxito durante muchos años. En el goniómetro euleriano (ver la figura a continuación) el cristal se orienta a través de los tres ángulos de Euler (tres círculos): Φ representa el eje de rotación alrededor de la cabeza del goniómetro (donde se monta el cristal), χ permite que el cristal ruede sobre el círculo cerrado, y ω permite que el goniómetro completo gire alrededor de un eje vertical. El cuarto círculo representa la rotación del detector, 2 θ, que es coaxial con ω. Esta geometría tiene la ventaja de una alta estabilidad mecánica, pero presenta algunas restricciones para que los dispositivos externos (por ejemplo, dispositivos de baja o alta temperatura) accedan al cristal.
Izquierda: Esquema y apariencia de un goniómetro de cuatro círculos con geometría euleriana
Derecha: Rotaciones en un goniómetro de cuatro círculos con geometría euleriana
Una alternativa a la geometría euleriana es la denominada geometría Kappa, que no tiene un equivalente al círculo χ cerrado. El papel de la rotación de χ euleriana se cumple mediante dos nuevos ejes: κ (kappa) y ω κ (véase la figura a continuación), de tal manera que con una combinación de ambos nuevos ángulos se pueden obtener ángulos χ eulerianos en el rango de -90 a +90 grados. La principal ventaja de esta geometría Kappa es la amplia accesibilidad al cristal. Los ángulos Φ y 2 θ son idénticos a los de la geometría euleriana:
Esquema y apariencia de un goniómetro de cuatro círculos con geometría Kappa
El sistema de detección ampliamente utilizado durante muchos años para ambas geometrías (Euler y Kappa) se basó en contadores de área pequeña o detectores de puntos. Con estos detectores la intensidad de los haces difractados debe medirse individualmente, uno tras otro, y por lo tanto todos los ángulos tuvieron que cambiarse automáticamente de acuerdo con valores previamente calculados. Los tiempos de medición típicos para tales sistemas detectores son alrededor de 1 minuto por reflexión.
Uno de los detectores puntuales más utilizados durante muchos años es el contador de centelleo, cuyo esquema se muestra a continuación:
Esquema de un contador de centelleo
Detectores de área
Como alternativa a los detectores puntuales, el desarrollo de la tecnología electrónica ha llevado a la aparición de los llamados detectores de área que permiten la detección de muchos haces de difracción simultáneamente, ahorrando así tiempo en el experimento. Esta tecnología es particularmente útil para proteínas y generalmente para cualquier material que pueda deteriorarse con su exposición a rayos X, ya que la detección de cada imagen recolectada (con varios cientos de reflejos) se realiza en un tiempo mínimo, del orden de minutos (o segundos si la fuente de rayos X es una sincrotrón).
Uno de los detectores de área más utilizados se basa en los llamados CCD (Charge Coupled Device) cuyo esquema se muestra a continuación:
Vista esquemática de un CCD con sus componentes principales. El convertidor de rayos X, en la figura mostrada como Fósforo, también se puede hacer con otros materiales, como GDoS, etc. El CCD convierte fotones de rayos X a alta velocidad, pero su desventaja es que opera a temperaturas muy bajas (alrededor de -70 C). Imagen tomada de ADSC Products
Los detectores tipo CCD suelen estar montados en goniómetros Kappa y su uso está muy extendido en el campo de la cristalografía de proteínas, con generadores de ánodo rotativos o fuentes de sincrotrón.
Izquierda: Goniómetro con geometría Kappa y detector CCD (Imagen tomada de Bruker-AXS )
Derecha: Detalles de un goniómetro Kappa (en este caso con un ángulo de κ fijo)
Otro tipo de detector ampliamente utilizado hoy en día, especialmente en cristalografía de proteínas, son los Escáneres de Placas de Imagen, que suelen estar montados sobre un goniómetro relativamente rudimentario, cuya única libertad es un eje de rotación paralelo al eje de montaje del cristal. El sensor en sí es una placa circular de material sensible a los rayos X. Después de la exposición, se utiliza un láser para escanear la placa y leer las intensidades.
Izquierda: Escáner de Placas de Imagen (imagen tomada de Marxperts )
Derecha: Componentes de un Escáner de Placas de Imagen
La última tecnología implica el uso de detectores de área basados en tecnología CMOS (c omplementary m etal- o xide s emiconductor) que tiene un tiempo de lectura muy corto, lo que permite aumentar las velocidades de cuadro durante los datos colección.
Detectores de área
XALOC, la línea de haz para cristalografía macromolecular (izquierda) en el sincrotrón español ALBA (derecha)
En resumen, una recopilación completa de datos con este tipo de detectores consiste en múltiples imágenes como las que se muestran a continuación. Las imágenes recolectadas se analizan posteriormente para obtener los datos de celdas unitarias cristalinas, simetría (grupo espacial) e intensidades del patrón de difracción (espacio recíproco). Este proceso se explica con más detalle en otra sección.
Izquierda: Imagen de difracción de una proteína, obtenida con el método de oscilación en un Escáner de Placas de Imagen. Durante el tiempo de exposición (aprox. 5 minutos con un generador de ánodo giratorio, o aprox. 5 segundos en una instalación de sincrotrón) el cristal gira aproximadamente 0.5 grados alrededor del eje de montaje. La lectura de la imagen toma aproximadamente 20 segundos (dependiendo del área de la placa de imagen). Esto también podría ser la aparición de una imagen tomada con un detector CCD. Sin embargo, con un CCD el tiempo de exposición sería más corto.
Derecha: Un conjunto de imágenes de difracción consecutivas obtenidas con un Escáner de Placas de Imagen o un detector CCD. Después de varias imágenes aparecen dos ojeras concéntricas, correspondientes a un número infinito de puntos recíprocos. Corresponden a dos órdenes de difracción consecutivos de microcristales de hielo orientados aleatoriamente que aparecen debido a algún defecto del crioprotector o a alguna humedad del nitrógeno frío utilizado para enfriar la muestra. Las imágenes son tomadas de Janet Smith Lab. Véase también el ejemplo publicado por Aritra Pal y Georg Sheldrick.
En todas estas metodologías experimentales descritas (excepto el método Laue), la radiación utilizada suele ser monocromática (o casi monocromática), es decir, radiación con una sola longitud de onda. Las radiaciones monocromáticas generalmente se obtienen con los llamados monocromadores, un sistema compuesto por cristales simples que, basados en la Ley de Bragg, son capaces de “filtrar” la radiación policromática de entrada y seleccionar solo una de sus longitudes de onda ( color), como se muestra a continuación:
Esquema de un monocromador. Una radiación policromática (blanca) procedente de la izquierda se “refleja”, según la Ley de Bragg, “filtrando” la radiación de entrada que se refleja nuevamente en un cristal secundario. Imagen tomada de ESRF.
En la actualidad, en los laboratorios cristalográficos o incluso en las líneas de sincrotrón, los monocromadores tradicionales están siendo reemplazados por nuevos componentes ópticos que han demostrado una eficacia superior. Estos componentes, generalmente conocidos como “espejos de enfoque”, pueden basarse en los siguientes fenómenos:
- reflexión total (espejos, capilares y guías de ondas),
- refracción (lentes de refracción) y
- difracción (sistemas cristalinos basados en monocromadores, materiales multicapa, etc.)
También puede ser muy instructivo observar este diagrama animado que muestra la trayectoria de cada fotón de rayos X en un sistema de difracción dado:
- el fotón sale de la fuente donde se producen los rayos X,
- atraviesa los diversos elementos ópticos que lo canalizan en la dirección correcta (espejos, hendiduras y colimadores)
- difracta dentro del monocristal, y
- finalmente genera los puntos de difracción en un detector
El video original se puede ver en https://vimeo.com/52155723
Para obtener la mayor y mejor colección de datos de difracción, las muestras de cristal generalmente se mantienen a una temperatura muy baja (aproximadamente 100 K, es decir, aproximadamente -170 C) usando una corriente de nitrógeno seco. A bajas temperaturas, los cristales (y especialmente los de las macromoléculas) son más estables y resisten mucho mejor los efectos de la radiación de rayos X. Al mismo tiempo, la baja temperatura reduce aún más los factores de vibración térmica atómica, facilitando su posterior ubicación dentro de la estructura cristalina.
Sistema de enfriamiento con nitrógeno líquido seco. Imagen tomada de Oxford Cryosystems
Para montar los cristales en la cabeza del goniómetro, frente a la corriente fría de nitrógeno, los cristógrafos utilizan bucles especiales (como el representado en la figura izquierda) que fijan el cristal en una matriz transparente a los rayos X.
Esto es especialmente útil para cristales proteicos, donde la matriz también actúa como crioprotector (anticongelante). Las moléculas del crioprotector se propagan a través de los canales cristalinos reemplazando las moléculas de agua por las crioprotectoras, evitando así la ruptura del cristal debido al agua congelada.
Izquierda: Detalle de un cristal montado usando un bucle relleno con una matriz anticongelante
Derecha: Comprobando la posición del cristal en el centro óptico goniométrico. Video cortesía de Ed Berry
En cualquier caso, el centro cristalino debe ser coincidente con el centro óptico del goniómetro, por donde también está pasando el haz de rayos X. De esta manera, cuando el cristal gira, siempre estará centrado en ese punto, y en cualquiera de sus posiciones será bañado por el haz de rayos X.
Sistema de crio-protección montado en un goniómetro
El flujo de nitrógeno a -170 º C (que viene a través del tubo superior) enfría el cristal montado en la cabeza del goniómetro. El colimador del haz de rayos X apunta hacia el cristal desde la izquierda de la imagen. Observe el ligero vapor generado por el nitrógeno frío cuando se mezcla con la humedad del aire.
Analizar visualmente la calidad del patrón de difracción
En resumen, todas estas metodologías pueden ser utilizadas para obtener una recolección de datos, consistente en tres índices Miller y una intensidad para cada haz difractado, es decir, el mayor número de puntos recíprocos de la red recíproca.
Esto implica evaluar tanto la geometría como las intensidades de todo el patrón de difracción.
Todos estos datos, dimensiones de celdas unitarias cristalinas, simetría cristalina (grupo espacial) e intensidades asociadas a los puntos recíprocos (patrón de difracción), nos permitirán “ver” la estructura interna del cristal, pero esta cuestión se mostrará en otro capítulo...