7.1: Por qué y cómo se realiza la espectroscopia CW EPR

Ventajas de sensibilidad de la espectroscopia CW EPR

En espectroscopía de RMN, las técnicas de CW han sido casi completamente desplazadas por las técnicas de transformada de Fourier (FT), excepto por algunas aplicaciones de nicho. Las técnicas FT tienen una ventaja de sensibilidad si el espectro contiene grandes secciones de línea base y todo el espectro puede ser excitado simultáneamente por los pulsos. Ninguna de las condiciones suele cumplirse en la espectroscopia EPR. Por dos razones, las técnicas FT pierden sensibilidad en la espectroscopia EPR en comparación con el experimento CW. Primero, mientras que los espectros de RMN típicos encajan cómodamente en el ancho de banda de un circuito de resonancia de radiofrecuencia acoplado críticamente bien diseñado, los espectros EPR son mucho más amplios que el ancho de banda de un resonador de microondas con factor de alta calidad. Ampliar el ancho de banda de detección y reducir proporcionalmente el factor\(Q\) de calidad del resonador reduce la relación señal/ruido a menos que la línea de absorción sea infinitamente amplia. Un factor de calidad del orden de 10 '000, que se puede lograr con resonadores de cavidad, corresponde a un ancho de banda de aproximadamente\(1 \mathrm{MHz}\) a frecuencias de banda X alrededor\(9.6 \mathrm{GHz}\). La alta sensibilidad intrínseca de detección en una banda tan estrecha solo puede usarse en un experimento de CW. Segundo, incluso si el resonador está sobreacoplado a un factor de calidad mucho más bajo o se\(Q\) utilizan resonadores con intrínsecamente más bajos (la pérdida de sensibilidad puede compensarse parcialmente por un factor de llenado más alto de tales resonadores), la potencia residual de un pulso de microondas de alta potencia requiere aproximadamente \(100 \mathrm{~ns}\)con el fin de decaimiento por debajo del nivel de una señal EPR. Este tiempo muerto suele ser una fracción significativa del tiempo de relajación transversal de los espines electrónicos, lo que conlleva la pérdida de señal por relajación. En contraste, en la espectroscopia de RMN el tiempo muerto suele ser despreciablemente corto en comparación con los tiempos de relajación. En muchos casos, el tiempo muerto en la espectroscopia de EPR pulsada incluso supera fuertemente\(T_{2}\). En esta situación FT EPR es imposible, incluso con el reenfoque de eco, mientras que los espectros CW EPR aún se pueden medir. Este caso generalmente se aplica a complejos de metales de transición a temperatura ambiente y a muchos complejos de metales de tierras raras y complejos de Fe (III) de alto espín incluso hasta el punto de ebullición del helio líquido a presión normal (4.2 K). Por estas razones, cualquier muestra desconocida potencialmente paramagnética debe caracterizarse primero por espectroscopía CW EPR. Se requieren técnicas de EPR pulsadas si la resolución de la espectroscopia CW EPR proporciona información insuficiente para asignar una estructura. Esto se aplica principalmente a pequeños acoplamientos hiperfinos en radicales orgánicos y de núcleos de ligandos en complejos de metales de transición (ver Capítulo 8) y a la medición de distancias entre espines de electrones en el rango nanométrico (ver Capítulo 9). A temperaturas donde se pueden obtener señales de pulso EPR, la medición de los tiempos de relajación también es más fácil y precisa con técnicas de EPR pulsadas.

Figura 7.1: Esquema de un espectrómetro CW EPR. El microondas de una fuente de frecuencia fija se pasa a través de un atenuador para ajustar su potencia y luego a través de un circulador a la muestra. El microondas que regresa de la muestra pasa de una manera diferente a través del mismo circulador y se combina con microondas de referencia de potencia ajustable (polarización) y fase antes de que sea detectado por un diodo de microondas. La señal de salida de este diodo ingresa a un detector sensible a la fase (PSD) donde se desmodula con respecto a la frecuencia de modulación de campo (típicamente\(100 \mathrm{kHz}\)) y al mismo tiempo se amplifica. La señal de salida del PSD se digitaliza y se procesa posteriormente en una computadora. El espectro se obtiene barriendo el campo magnético estático\(B_{0}\) a frecuencia constante de microondas.

El experimento CW EPR

Dado que el ancho de banda de un resonador de microondas optimizado es mucho menor que el ancho típico de los espectros EPR, no es práctico barrer la frecuencia en un campo magnético constante para obtener un espectro. En cambio, la frecuencia de microondas se mantiene constante y coincide con la frecuencia del resonador en todo momento. La condición de resonancia para los giros se establece barriendo el campo magnético\(B_{0}\). Otra dificultad surge del débil acoplamiento magnético de los giros al excitante campo electromagnético. Por lo tanto, solo se observa una fracción muy pequeña de la potencia de excitación. Este problema se resuelve de la siguiente manera. En primer lugar, se evita la transmisión directa de la potencia de excitación al detector mediante un circulador (Figura 7.1). La energía que ingresa al puerto 1 solo puede salir a la muestra a través del puerto 2. La potencia que viene de la muestra a través del puerto 2 solo puede dejar al diodo detector a través del puerto 3. Segundo, el resonador está acoplado críticamente. Esto significa que toda la potencia de microondas procedente de la fuente que incide en el resonador entra en el resonador y es convertida en calor por la impedancia (resistencia compleja) del resonador. Si la muestra está apagada resonante y por lo tanto no absorbe microondas, ninguna energía de microondas sale del resonador a través del puerto 3. Si ahora el campo magnético\(B_{0}\) se ajusta a la condición de resonancia y la muestra absorbe resonantemente microondas, esto significa que la impedancia del resonador + muestra ha cambiado. El resonador ya no está acoplado críticamente y parte del microondas entrante se refleja. Este microondas sale del circulador a través del puerto 3 y es incidente en el diodo detector.

Esta potencia reflejada en la absorción de resonancia puede ser muy débil a una concentración de muestra baja. Por lo tanto, es importante detectarlo con sensibilidad. Un diodo de microondas solo es débilmente sensible a un cambio en la potencia incidente a baja potencia (Fig. 7.2, el voltaje de entrada es proporcional a la raíz cuadrada de la potencia). El diodo es más sensible a los cambios de amplitud cerca de su punto de funcionamiento, marcado en verde en la Fig. 7.2. Por lo tanto, el diodo debe estar polarizado a su punto de funcionamiento agregando potencia constante desde un brazo de referencia. La fase del brazo de referencia debe ajustarse para que el microondas procedente del resonador y el microondas procedente del brazo de referencia interfieran constructivamente.

Figura 7.2: Curva característica de un diodo de detección de microondas. A un voltaje de entrada pequeño, el diodo es bastante insensible a los cambios en el voltaje de entrada. En el punto de operación (verde), la dependencia de la corriente de salida de la tensión de entrada es lineal y tiene pendiente máxima. Esto corresponde a la corriente\(200 \mu \mathrm{A}\) de salida. Si el voltaje de entrada es demasiado grande, el diodo se destruye (punto rojo).

Otro problema surge del hecho de que los diodos de microondas son detectores de banda ancha. Por un lado, esto es útil, ya que las muestras pueden desplazar significativamente la frecuencia del resonador. Por otro lado, los detectores de banda ancha también recogen ruido de una amplia banda de frecuencias. Esto disminuye la relación señal/ruido y debe contrarrestarse limitando el ancho de banda de detección al ancho de banda de la señal o incluso por debajo. Dicha limitación de ancho de banda se puede realizar más fácilmente mediante modulación de efectos y detección sensible a la fase. Al aplicar una modulación de campo magnético sinusoidal pequeña con frecuencia típica\(100 \mathrm{kHz}\) y amplitud típica de\(0.01-1 \mathrm{mT}\), el componente de señal en la salida del diodo detector se modula con la misma frecuencia, mientras que el ruido no está correlacionado con la modulación. La demodulación con una señal de referencia del generador de modulación de campo (Figura 7.1) por un detector sensible a la fase amplifica la señal y limita el ancho de banda a la frecuencia de modulación.

La modulación de efectos con detección sensible a fase mide la derivada de la línea de absorción, siempre y cuando la amplitud de modulación\(\Delta B_{0}\) sea mucho menor que la anchura de la línea EPR (Fig. 7.3). Dado que la relación señal-ruido es proporcional a\(\Delta B_{0}\), uno suele medir en\(\Delta B_{0} \approx \Delta B_{\mathrm{pp}} / 3\), donde la distorsión de la forma de línea es tolerable para casi todas las aplicaciones. El análisis preciso de la forma de línea puede requerir\(\Delta B_{0} \leq \Delta B_{\mathrm{pp}} / 5\), mientras que la máxima sensibilidad a expensas del ensanchamiento artificial significativo de la línea se obtiene en\(\Delta B_{0}=\Delta B_{\mathrm{pp}}\). La frecuencia de modulación no debe ser más amplia que el ancho de línea en las unidades de frecuencia. Sin embargo, con la frecuencia de modulación estándar\(100 \mathrm{kHz}\) que corresponde en una escala de campo magnético a solo\(3.6 \mu \mathrm{T}\) at\(g=g_{e}\), esto rara vez es un problema.

Consideraciones sobre la preparación de muestras

Dado que los espines electrónicos tienen un momento magnético mucho mayor que los espines nucleares, los acoplamientos electrón-electrón conducen a un ensanchamiento significativo de la línea en soluciones concentradas. Las concentraciones de los centros paramagnéticos generalmente no deben exceder\(1 \mathrm{mM}\) para evitar dicha ampliación. Para los radicales orgánicos en solución líquida puede ser necesario diluir la muestra a\(100 \mu \mathrm{M}\) fin de lograr la resolución final. Para los dopantes metálicos paramagnéticos en compuestos hospedadores diamagnéticos, en la mayoría\(1 \%\) de los sitios diamagnéticos deben ser sustituidos por centros paramagnéticos. Dichas concentraciones se pueden detectar fácilmente y con buena relación señal/ruido. Para la mayoría de las muestras, se pueden obtener buenos espectros hasta el\(1 \mu \mathrm{M}\) rango en solución y hasta el rango de dopante de 100 ppm en sólidos.

El ensanchamiento de la línea en solución líquida también puede surgir de la colisión difusional de paramagnéticos

Figura 7.3: Detección de la forma de línea derivada por modulación de campo. La situación se considera en el campo instantáneo durante un barrido de campo (línea discontinua vertical) que es lento en comparación con la frecuencia de modulación de campo de\(100 \mathrm{kHz}\). La modulación del campo magnético con amplitud\(\Delta B_{0}\) (azul) provoca una modulación de la señal de salida\(V\) (roja) con la misma frecuencia y una amplitud\(\Delta V\). La detección sensible a la fase mide esta amplitud\(\Delta V\), que es proporcional a la derivada de la forma de línea de absorción gris y a\(\Delta B_{0}\), siempre que\(\Delta B_{0}\) sea mucho menor que el ancho de línea pico a pico\(\Delta B_{\mathrm{pp}}\) de la línea. En la práctica,\(\Delta B_{0}<\Delta B_{\mathrm{pp}} / 3\) suele ser aceptable. Para un análisis preciso de la forma de línea,\(\Delta B_{0}<\Delta B_{\mathrm{pp}} / 5\) se recomienda.

Figura 7.4: Mejora de la relajación por intercambio de colisiones con oxígeno en solución. a) Situación previa al encuentro difusional. Como ejemplo, se supone que el oxígeno triplete está en un\(\mathrm{T}_{-}\) estado (rojo), mientras que se supone que el espín de un radical nitróxido es\(\alpha\) (verde). b) La molécula de oxígeno y el radical nitróxido han colisionado durante el encuentro difusional. Sus funciones de onda se superponen y los tres electrones desapareados no pueden distinguirse entre sí (gris). (c) Después de la separación, los tres electrones desapareados se han redistribuido arbitrariamente a las dos moléculas. Por ejemplo, ahora el oxígeno puede estar en el\(\mathrm{T}_{0}\) estado (rojo) y el nitróxido en el\(\beta\) estado (verde). El espín electrónico del radical nitróxido se ha volteado.

especies con oxígeno triplete paramagnético (Figura 7.4). Durante tal colisión, las funciones de onda de las dos moléculas se superponen y, dado que los electrones son partículas indistinguibles, los estados de espín de todos los electrones desapareados en ambas moléculas se redistribuyen arbitrariamente cuando las dos moléculas se separan de nuevo. Los encuentros difusionales estocásticos conducen así a giros adicionales de los espines de electrones observados, lo que corresponde a la relajación y acorta el tiempo de relajación longitudinal\(T_{1}\). Dado que el ancho de línea es proporcional\(T_{2}\) y\(T_{2}\) no puede ser mayor que\(2 T_{1}\), los frecuentes encuentros colisionales de especies paramagnéticas conducen al ensanchamiento de la línea. Dicha ampliación de línea aumenta con la disminución de la viscosidad (difusión más rápida) y el aumento de la concentración de oxígeno El efecto es más fuerte en disolventes apolares, donde la solubilidad de oxígeno es mayor que en los disolventes polares, pero a menudo es significativo incluso en solución acuosa. La mejor resolución se obtiene si la muestra está libre de oxígeno. El mismo mecanismo conduce al ensanchamiento de líneas a alta concentración de una especie paramagnética en solución líquida. En estado sólido, el ensanchamiento de la línea a alta concentración se debe principalmente al acoplamiento dipolo-dipolo. A menudo, el espectro de EPR ampliado anisotrópicamente en estado sólido es de interés, ya que proporciona información sobre\(g\) anisotropía y acoplamientos hiperfinos anisotrópicos. Esto puede requerir la congelación de una solución de la especie de interés. Por lo general, la especie precipitará si el disolvente cristaliza, lo que puede provocar el ensanchamiento de la línea y, en casos extremos, incluso el colapso de la estructura hiperfina y el promedio de\(g\) anisotropía por intercambio entre especies paramagnéticas vecinas. Estos problemas se evitan si el disolvente forma un vidrio, como suele ser el caso de los disolventes que tienen grupos metilo o pueden formar enlaces de hidrógeno en geometrías muy diferentes. Los disolventes formadores de vidrio típicos son tolueno, 2-metiltetrahidrofurano, etanol, etilenglicol y glicerol. Las soluciones acuosas requieren la adición de al menos\(25 \%\) glicerol como crioprotector. En la mayoría de los casos, la cristalización seguirá ocurriendo con enfriamiento lento. Por lo tanto, las muestras se congelan por choque por inmersión del tubo de muestra en nitrógeno líquido. Los tubos de vidrio se romperían por inmersión directa en nitrógeno líquido, pero los espectros EPR tienen que medirse en tubos de muestra de sílice fundida de todos modos, ya que el vidrio contiene invariablemente una cantidad detectable de impurezas paramagnéticas de hierro.