8.1: ENDOR

Ventajas de la detección de espectros de frecuencia nuclear basada en espín electrónico

Los espectros de frecuencia nuclear en los estados líquido (Sección 4.3.2) y sólido (4.3.4) presentan una resolución hiperfina mucho mejor que los espectros EPR, debido a que los espectros anteriores presentan menos líneas y más estrechas. De hecho, los pequeños acoplamientos hiperfinos a núcleos de ligando en complejos metálicos no suelen resolverse en espectros EPR y solo los acoplamientos hiperfinos más grandes pueden resolverse en espectros EPR de estado sólido. Los espectros de frecuencia nuclear no se pueden medir con un espectrómetro de RMN dedicado porque se extienden sobre varios megahercios a varias decenas de megahercios, mientras que los espectrómetros de RMN están diseñados para anchos de banda de excitación y detección de algunas decenas de kilohercios. Además, las transiciones de espín electrónico tienen 660 veces más polarización que las transiciones de protones y más que la de otros núcleos. Su mayor momento magnético también conduce a una mayor sensibilidad de detección. Por lo tanto, es ventajoso transferir la polarización de espines de electrones a espines nucleares y retrotransferir la respuesta de los espines nucleares a los espines de electrones para su detección. Dos clases de experimentos pueden lograr esto, los experimentos de doble resonancia nuclear electrónica (ENDOR), discutidos en la Sección\(8.1\) y los experimentos de modulación de envolvente de eco de espín electrónico (ESEEM) discutidos en la Sección 8.2

Tipos de experimentos ENDOR

Se puede realizar un experimento ENDOR con una fuerte irradiación CW de espines electrónicos y nucleares. En este experimento CW ENDOR, una transición de espín electrónico está parcialmente saturada,\(S \gg 1\) en la Ec. (7.5). Al conducir una transición de espín nuclear que comparte un nivel de energía con la transición saturada, se abren vías de relajación adicionales. La transición de espín electrónico bajo observación es así parcialmente desaturada y se observa un aumento en la señal EPR. El experimento se realiza en campo magnético constante con fuerte irradiación de microondas a un máximo del espectro de absorción de primera derivada (es decir, el espectro CW EPR) y la señal EPR se registra en función de la frecuencia de irradiación de radiofrecuencia adicional, que debe cumplir con la saturación condición\(S \gg 1\) para los giros nucleares. Por lo general, la irradiación por radiofrecuencia es modulada en frecuencia y la respuesta se detecta con otro detector sensible a la fase, lo que lleva a la observación de la primera derivada del espectro de frecuencias nucleares. El experimento CW ENDOR depende críticamente de un equilibrio de tiempos de relajación, por lo que en estado sólido solo se puede lograr una sensibilidad suficiente en un cierto rango de temperatura. Además, la irradiación continua fuerte simultánea tanto por microondas como por radiofrecuencia, mientras se mantiene constante la frecuencia y la temperatura del resonador, es experimentalmente desafiante. Por lo tanto, CW ENDOR ha sido reemplazado en gran medida por técnicas ENDOR pulsadas Sin embargo, para muestras de solución líquida CW ENDOR suele ser la única técnica ENDOR aplicable.

El experimento ENDOR pulsado conceptualmente más simple es Davies ENDOR (Sección 8.1.3), donde la saturación de la transición EPR es reemplazada por inversión por un\(\pi\) pulso (Fig. 8.1 (a)). Un\(\pi\) pulso de radiofrecuencia posterior, que es on-resonante con una transición que comparte un nivel con la transición EPR invertida, cambia la población de este nivel y así la polarización de la transición del observador EPR. Este cambio de polarización en función de la radiofrecuencia se observa mediante un experimento de eco de Hahn en la transición del observador. El enfoque funciona bien para acoplamientos hiperfinos moderadamente grandes\((>3 \mathrm{MHz})\), en particular para\({ }^{14} \mathrm{~N}\) núcleos coordinados directamente con un ion de metal de transición o para protones a una distancia de enlace de hidrógeno o distancias de hasta aproximadamente\(4 \AA\). Como veremos en la Sección 8.1.3, el experimento es bastante insensible para acoplamientos hiperfinos muy pequeños.

Figura 8.1: Secuencias ENDOR pulsadas. a) Davies ENDOR. Un\(\pi\) pulso de inversión selectiva en los espines electrónicos es seguido por un retardo\(T\) y detección de eco de Hahn (rojo). Durante el retardo interpulso de microondas\(T\), se aplica un\(\pi\) pulso de radiofrecuencia variable en frecuencia (azul). Si este pulso está encendido resonante con una transición nuclear, el eco invertido se recupera (azul pálido). b) Mims ENDOR. Una secuencia de eco estimulada no selectiva con retardos interpulso\(\tau\) y\(T\) se aplica a los espines de electrones (rojo). Durante el retardo interpulso de microondas\(T\), se aplica un\(\pi\) pulso de radiofrecuencia variable en frecuencia (azul). Si este pulso está encendido resonante con una transición nuclear, el eco estimulado se atenúa (azul pálido).

Los acoplamientos hiperfinos más pequeños se pueden detectar con el experimento Mims ENDOR que se basa en la secuencia de eco estimulado\((\pi / 2)-\tau-(\pi / 2)-T-(\pi / 2)-\tau-e c h o(\) Fig. \(8.1(\)b)\()\)). El bloque de preparación\((\pi / 2)-\tau-(\pi / 2)\) crea una rejilla de polarización de la forma funcional\(A\left(\Omega_{S}\right) \cos \left(\Omega_{S} \tau\right)\), donde\(A\left(\Omega_{S}\right)\) está el espectro de absorción EPR en función del desplazamiento de resonancia\(\Omega_{S}\) y\(\tau\) es el retardo entre los dos \(\pi / 2\)pulsos de microondas. Se aplica un\(\pi\) pulso de radiofrecuencia con frecuencia variable durante el tiempo\(T\) en que la magnetización de espín electrónico se alinea con el\(z\) eje. Si este pulso está encendido resonante con una transición nuclear que comparte un nivel con la transición EPR del observador, la mitad de la rejilla de polarización es desplazada por la división hiperfina\(A_{\text {eff }}\), como también se hará evidente en la Sección 8.1.3. Porque\(A_{\text {eff }} \tau=2(k+1) \pi\) con entero\(k\) la rejilla de polarización es destruida por interferencia destructiva. Dado que el eco estimulado es el decaimiento de inducción libre (FID) de esta rejilla de polarización, es cancelado por un pulso de radiofrecuencia que está en resonancia con una transición nuclear. Es evidente que el\(\pi\) pulso de radiofrecuencia no tiene efecto para\(A_{\text {eff }} \tau=2 k \pi\) con entero\(k\), donde las rejillas originales y de frecuencia desplazada interfieren constructivamente. Por lo tanto, el experimento Mims ENDOR presenta puntos ciegos en función del retardo interpulso\(\tau\). Estos puntos ciegos no son un problema grave para acoplamientos hiperfinos muy pequeños\(A_{\mathrm{eff}} \ll \pi / \tau\). Tenga en cuenta sin embargo que el primer punto ciego corresponde a\(A_{\mathrm{eff}}=0\). Por lo tanto,\(\tau\) se requieren retardos interpulso largos para detectar acoplamientos hiperfinos muy pequeños, lo que conduce a una fuerte atenuación del eco por un factor\(\exp \left(-2 \tau / T_{2}\right)\) debido a la relajación transversal del espín electrónico. Se puede demostrar que la máxima sensibilidad para acoplamientos muy pequeños se alcanza aproximadamente a\(\tau=T_{2}\).

Figura 8.2: Transferencia de polarización en Davies ENDOR. (a) Poblaciones niveladas en equilibrio térmico, correspondientes a la marca verde 0 en la Fig. 8.1 (a). Las transiciones electrónicas (rojo, rojo pálido) están mucho más polarizadas que las transiciones nucleares (azul, azul pálido). (b) Poblaciones niveladas después de un pulso selectivo de inversión de mw en resonancia con la\(|\beta \alpha\rangle \leftrightarrow|\alpha \alpha\rangle\) transición (rojo oscuro), correspondiente a la marca verde 1 en la Fig. 8.1 (a). Se genera un estado de orden de dos espines, donde las dos transiciones de espín de electrones se polarizan con signo opuesto y lo mismo es cierto para las dos transiciones de espín nuclear. (c) Poblaciones niveladas después de un pulso de inversión selectiva de rf en resonancia con la\(|\alpha \alpha\rangle \leftrightarrow|\alpha \beta\rangle\) transición (azul oscuro), correspondiente a la etiqueta verde 2 en la Fig. 8.1 (a). La transición del observador de espín electrónico ya no\(|\beta \alpha\rangle \leftrightarrow|\alpha \alpha\rangle\) está invertida, sino saturada.

Davies ENDOR

El experimento Davies ENDOR se entiende más fácilmente al observar las transferencias de polarización. En equilibrio térmico, las transiciones de espín electrónico (rojo y rojo pálido) están mucho más polarizadas que las transiciones de espín nuclear (Fig. 8.2 (a)). Sus frecuencias difieren por una división hiperfina efectiva\(A_{\text {eff }}\) a un espín nuclear\(I=1 / 2\) que es azul codificado por colores. El primer\(\pi\) pulso de microondas es selectivo para la transición, es decir, tiene un ancho de banda de excitación que es menor que\(A_{\text {eff }}\). En consecuencia, invierte solo una de las dos transiciones de espín electrónico. Suponemos que la\(|\beta \alpha\rangle \leftrightarrow|\alpha \alpha\rangle\) transición (roja) está invertida y la\(|\beta \beta\rangle \leftrightarrow|\alpha \beta\rangle\) transición (rojo pálido) no se invierte; el otro caso es análogo. Dicha inversión selectiva de transición conduce a un estado de orden de dos espines, donde todas las transiciones individuales en el sistema de dos espinas están polarizadas. Sin embargo, las dos transiciones de espín electrónico están polarizadas con signo opuesto y las dos transiciones nucleares también están polarizadas con signo opuesto (Fig. 8.2 (b)). Ahora se aplica un\(\pi\) pulso de radiofrecuencia. Si este pulso no es resonante con una transición nuclear, el estado de orden de dos espines persiste y la transición de espín electrónico observador (rojo) aún está invertida. El pulso de radiofrecuencia también es selectivo para la transición. Ahora asumimos que este pulso invierte la\(|\alpha \alpha\rangle \leftrightarrow|\alpha \beta\rangle\) transición (azul); el otro caso vuelve a ser análogo. Después de dicho pulso de radiofrecuencia resonante, las dos transiciones nucleares se polarizan con signo igual y las dos transiciones de espín electrónico se saturan sin polarización existente en ellas (Fig. 8.2 (c)). Después del\(\pi\) pulso de radiofrecuencia se aplica una secuencia de eco Hahn de microondas resonante con la transición del observador (Fig. 8.1 (a)). Si el pulso de radiofrecuencia estaba apagado resonante (situación como en la Fig. 8.2 (b)), se observa un eco invertido. Si, por otro lado, el pulso de radiofrecuencia estaba en resonancia (situación como en la Fig. 8.2 (c)) no se observa eco. En la práctica, las transferencias de polarización no son completas y aún se observa un eco débil. Sin embargo, un pulso de radiofrecuencia resonante provoca cierta recuperación del eco invertido. Si se varía la radiofrecuencia, se observa recuperación del eco invertido en todas las frecuencias donde el pulso de radiofrecuencia es resonante con una transición nuclear.

Figura 8.3: Explicación de quema de agujeros espectrales de Davies ENDOR. (a) Una línea EPR deshomogéneamente ensanchada con ancho\(\Gamma_{\text {inhom }}\) (rojo) consiste en muchas líneas más estrechas homogéneamente ensanchadas con ancho de línea\(\Gamma_{\text {hom }}\). (b) La irradiación de microondas débil larga satura el paquete de espín resonante y no afecta significativamente a los paquetes de espín fuera de resonancia. Un agujero espectral se quema en la línea deshomogéneamente ensanchada, que puede ser tan estrecha como\(\Gamma_{\text {hom. }}\). (c) Un\(\pi\) pulso selectivo de microondas quema un orificio de inversión en la línea EPR cuyo ancho es aproximadamente el ancho inverso del pulso. d) Situación después de aplicar un pulso de radiofrecuencia resonante. Para el paquete de giro, donde el pulso de microondas estaba encendido-resonante con la\(|\beta \alpha\rangle \leftrightarrow|\alpha \alpha\rangle\) transición, la mitad del agujero espectral se desplaza\(A_{\text {eff }}\) a frecuencias EPR más bajas. Para el paquete de giro donde el pulso de microondas estaba encendido-resonante con la\(|\beta \beta\rangle \leftrightarrow|\alpha \beta\rangle\) transición, la mitad del agujero espectral se desplaza\(A_{\text {eff }}\) a frecuencias EPR más altas. Considerando ambos casos, la mitad del agujero persiste, correspondiente a la saturación. Se crean dos agujeros laterales con un cuarto de la profundidad del orificio de inversión en\(\omega_{\mathrm{mw}} \pm A_{\mathrm{eff}}\). Estos agujeros laterales no contribuyen a la señal de eco, siempre y cuando estén fuera de la ventana de detección (rojo pálido) cuyo ancho está determinado por el ancho de banda de excitación de la secuencia de detección de eco de Hahn.

Se obtiene una mayor comprensión de Davies ENDOR considerando una línea EPR no homogéneamente ensanchada (Fig. 8.3). En tal línea con ancho\(\Gamma_{\text {inhom }}\), cada paquete de giro individual con un ancho mucho más estrecho\(\Gamma_{\text {hom }}\) puede, en principio, excitarse selectivamente. Un\(\pi\) pulso rectangular largo invierte el paquete de giro en resonancia y parcialmente invierte los paquetes de giro aproximadamente sobre un ancho de banda correspondiente a la longitud inversa del pulso. En Davies ENDOR, longitudes de pulso entre 50 y\(400 \mathrm{~ns}\), correspondientes a anchos de banda de excitación entre 20 y\(2.5 \mathrm{MHz}\) son típicas. Tal pulso crea un orificio de inversión centrado en la frecuencia de microondas\(\omega_{\text {mw }}\). En un sistema de espín\(S=1 / 2, I=1 / 2\) electrón-nuclear, existen dos paquetes de espín on-resonante, aquellos donde\(\omega_{\mathrm{mw}}\) está la frecuencia de la\(|\beta \alpha\rangle \leftrightarrow|\alpha \alpha\rangle\) transición y aquellos donde es la frecuencia de la\(|\beta \beta\rangle \leftrightarrow|\alpha \beta\rangle\) transición. Para el primer paquete de giro, la inversión del giro nuclear del\(|\beta\rangle\) al\(|\alpha\rangle\) estado aumenta la frecuencia de EPR por la división hiperfina efectiva\(A_{\text {eff }}\), mientras que para el último paquete, la inversión del\(|\alpha\rangle\) al \(|\beta\rangle\)estado lo disminuye por\(A_{\text {eff }}\). En ambos casos, la mitad del agujero de inversión se desplaza a un orificio lateral, dejando un orificio de saturación\(\omega_{m w}\) y creando un orificio lateral de saturación. Los agujeros centrales de saturación de los dos paquetes de giro coinciden en frecuencia y se combinan con un agujero de saturación en la línea deshomogéneamente ensanchada. En las frecuencias de los orificios laterales\(\omega_{\mathrm{mw}} \pm A_{\mathrm{eff}}\), solo uno de los dos paquetes de giro contribuye al agujero, de manera que los orificios laterales son solo la mitad de profundos. La subsecuencia de eco de Hahn en la secuencia ENDOR de Davies debe tener un ancho de banda de detección que cubra solo el orificio central (rojo pálido en la Fig. \(8.3(\mathrm{~d})\)), ya que no se observaría ningún efecto ENDOR si también se cubriera el orificio lateral. Para ello, el ancho de banda de detección de la secuencia de eco de Hahn se puede limitar ya sea mediante el uso de pulsos de microondas suficientemente largos o mediante el uso de una puerta de integración suficientemente larga para el eco invertido.

En cualquier caso, un efecto Davies ENDOR solo se observa si\(A_{\text {eff }}\) excede el ancho del agujero de inversión original. Cuanto más pequeño\(A_{\mathrm{eff}}\), más largo debe ser el primer pulso de inversión y menos paquetes de giro contribuyen a la señal. En general, no se pueden detectar divisiones hiperfinas mucho más pequeñas que el ancho de línea homogéneo\(\Gamma_{\text {hom }}=1 / T_{2}\) en el espectro EPR. En la práctica, Davies ENDOR se vuelve muy insensible para longitudes de\(\pi\) pulso superiores a 400 ns. Si el ensanchamiento del agujero de inversión por relajación del espín electrónico es insignificante, la supresión de señales con pequeños acoplamientos hiperfinos en Davies ENDOR puede describirse mediante un parámetro de selectividad

\[\eta_{\mathrm{S}}=\frac{A_{\mathrm{eff}} t_{\pi}^{(1)}}{2 \pi}\]

donde\(t_{\pi}^{(1)}\) la longitud del primer\(\pi\) pulso mw. Se obtiene la intensidad\(V_{\max }\) de ENDOR absoluta máxima para\(\eta_{\mathrm{S}}=\sqrt{2} / 2\). En función de\(\eta_{\mathrm{S}}\), la intensidad absoluta de ENDOR viene dada por

\[V\left(\eta_{\mathrm{S}}\right)=V_{\max }\left(\frac{\sqrt{2} \eta_{\mathrm{S}}}{\eta_{\mathrm{S}}^{2}+1 / 2}\right)\]

La selectividad de contraste hiperfina descrita por la Ec. (8.2) puede ser utilizada para la edición espectral. Por ejemplo,\({ }^{14} \mathrm{~N}\) ENDOR señala átomos de nitrógeno del ligando directamente coordinados en complejos de metales\(A_{\text {eff }}\) de transición con del orden de\(20-40 \mathrm{MHz}\) superposición con señales\({ }^{1} \mathrm{H}\) ENDOR de protones de ligando débilmente acoplados a frecuencias de banda X. En una longitud de pulso de inversión de aproximadamente\(50 \mathrm{~ns}^{1} \mathrm{H}\) ENDOR las señales son suprimidas en gran medida.

La ventaja de sensibilidad de Mims ENDOR para acoplamientos hiperfinos muy pequeños también se puede entender en la imagen de grabación de agujeros. En lugar de un solo orificio central, un bloque de preparación\((\pi / 2)-\tau-(\pi / 2)\) con pulsos de microondas no selectivos crea una rejilla de polarización que se puede imaginar como un peine de muchos agujeros que están espaciados por diferencia de frecuencia\(1 / \tau\). El ancho de cada agujero es aproximadamente\(1 / 2 \tau\). El ancho del peine de agujeros está determinado por la longitud inversa de los\(\pi / 2\) pulsos no selectivos, que suelen ser\(10 \mathrm{~ns}\) largos. Para acoplamientos pequeños, donde\(t_{\pi}^{(1)}\) en Davies ENDOR necesita ser muy largo, más de un orden de magnitud más paquetes de giro participan en un experimento Mims ENDOR que en un experimento de Davies ENDOR. El efecto Mims ENDOR surge del desplazamiento de una cuarta parte de la rejilla de polarización por diferencia de frecuencia\(+A_{\text {eff }}\) y una cuarta parte de la rejilla por\(-A_{\text {eff }}\). Las rejillas desplazadas interfieren con la rejilla en la frecuencia central. Dependiendo de\(A_{\text {eff }}\) y de la periodicidad\(1 / \tau\) de la rejilla, esta interferencia es destructiva (efecto ENDOR) o constructiva (sin efecto ENDOR).