2.1: Acerca de la anhidrasa carbónica

Introducción

La hidratación de dióxido de carbono (CO2) y su mecanismo en los sistemas vivos son de fundamental importancia para la química bioinorgánica. En 1932 se estableció la existencia de una enzima que cataliza la hidratación de CO2 en los glóbulos rojos,31 La enzima se denominó anhidrasa carbónica (abreviada CA). En 1939 se reconoció que la enzima contenía zinc (Zn) .32 Debido a que el CO2 es el punto de partida para la fotosíntesis o el punto final de la oxidación del sustrato, ahora se sabe que las anhidrasas carbónicas son ubicuas y ocurren en animales, plantas, bacterias y hongos. Diferentes enzimas de diferentes fuentes, que catalizan la misma reacción y suelen tener estructuras homólogas, se denominan isoenzimas. Hasta el momento, se han identificado un total de 7 clases distintas de CAs basadas en organismos: alfa, beta, gamma, delta, zeta, eta y theta. Cada clase puede contener múltiples isoenzimas. En ocasiones el mismo organismo tiene más de una isoenzima para una función particular, como es cierto para la anhidrasa carbónica humana. Los humanos tienen 15 CA que pertenecen a la clase alfa; estas isozimas varían según la ubicación en el cuerpo y por la actividad catalítica. El CA es un ejemplo clásico de una enzima hidrolítica, una que cataliza la adición o eliminación de agua a una molécula sustrato. Más específicamente, el CA cataliza la conversión reversible de dióxido de carbono (CO2) a bicarbonato (HCO3-), también denominado ácido carbónico.

Aunque la hidratación del CO2 es espontánea en agua a pH 7, la reacción es cinéticamente lenta (k = 10-1 s-1), demasiado lenta para convertir todo el CO2 producido en la respiración. Solo por encima de pH 9 la reacción no catalizada se vuelve rápida, debido al ataque directo de OH-, que es un nucleófilo mucho mejor que H2O (k = 104 M-1 s-1, donde M-1 se refiere a la concentración de OH-). La siguiente figura compara el ataque nucleofílico del agua versus el hidróxido (OH-) sobre CO2.

Figura: Esta figura representa el ataque nucleofílico al carbono en dióxido de carbono (CO 2) en la formación de bicarbonato (HCO 3 -). En el panel superior, H 2 O es el nucleófilo. El panel inferior muestra la reacción con hidróxido (OH -) como nucleófilo. Dado que el OH - es un nucleófilo más fuerte, la formación de HCO 3 es más rápida cuando OH - es el nucleófilo.

Entre H2O y OH-, la formación de HCO3- ocurre más rápido cuando OH- es el nucleófilo. Una reacción más rápida a pH más alto, cuando hay más iones OH-, sugiere que el OH- está involucrado en la etapa de determinación de la velocidad. Sin embargo, de manera realista, el pH de la sangre humana no se puede cambiar para acelerar la hidratación del CO2. En cambio, los humanos usan anhidrasa carbónica para catalizar la reacción. Cuando el CA está presente, la reacción se acelera a una velocidad de k = 106 s-1.

La ubicuidad de CA en diferentes organismos refleja la importancia de estas enzimas en el sustento de la vida. La velocidad de hidratación de CO2 catalizada por Ca es esencial para satisfacer las necesidades de las células vivas. Algunas funciones fisiológicas de CA incluyen regulación del pH, secreción de electrolitos, transporte de iones y homeostasis de CO2. En el tracto digestivo, los CAs juegan un papel en la secreción de ácido y mantienen la saliva neutra al modular Ph.g, H Entre estas funciones, CA juega un papel más destacado en el transporte de CO2 y HCO3- relacionado con la respiración, el proceso de intercambio de oxígeno atmosférico y dióxido de carbono que ocurre cuando los humanos inhalan oxígeno y dióxido de carbono exhalado. Con baja solubilidad, el CO2 debe convertirse a una forma más soluble, HCO3-, para su transporte por todo el cuerpo. El ion bicarbonato (HCO3-) finalmente llega a los pulmones, se convierte de nuevo en CO2 y sale del cuerpo a través de la exhalación.C

La investigación médica que gira en torno a la CA se centra en el sitio activo que contiene Zn como diana terapéutica para diversos tratamientos de enfermedades; tanto los inhibidores de CA como los activadores se incorporan en el diseño de fármacos. Los inhibidores de CA se utilizan como tratamiento para la epilepsia, úlceras, cáncer, obesidad y otros trastornos neurológicos. En el ojo, el CA produce iones de hidrógeno que mantienen la presión óptica. Sin embargo, demasiada presión en el ojo puede dañar el nervio óptico y causar glaucoma. La actividad de CA puede crear un gradiente de concentración que impulsa el transporte de agua al nervio óptico. Cuando hay demasiada agua alrededor del nervio óptico, la presión alrededor del nervio aumenta causando daño. La inhibición de la CA se ha convertido en un tratamiento clave del glaucoma.

Más allá de las aplicaciones farmacéuticas, CA también ha sido investigada por su utilidad en la captura de carbono y aplicaciones de sensores de carbono. La captura y almacenamiento de carbono ocurre cuando las CAs convierten el CO2 en bicarbonato. El aumento de la disponibilidad de bicarbonato en presencia de iones calcio (Ca2+) provoca precipitación de calcita (CaCO3). Este proceso, llamado bio-mineralización, puede ser un modo viable de almacenamiento a largo plazo de CO2 en calcita para mitigar las emisiones de CO2.

Los detalles sobre la estructura y función del sitio activo que contiene Zn de CA han sido dilucidados a lo largo de 80 años de investigación. El presente artículo profundiza en el sitio activo de metaloenzimas utilizando conceptos bioinorgánicos.

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La hidratación de dióxido de carbono y su mecanismo en los sistemas vivos son de fundamental importancia para la química bioinorgánica. En 1932 se estableció la existencia de una enzima catalizadora de la hidratación de CO ₂ en los glóbulos rojos, ³¹ La enzima se denominó anhidrasa carbónica (abreviada CA). En 1939 se reconoció que la enzima contenía zinc. ³² Debido a que el CO ₂ es el punto de partida para la fotosíntesis o el punto final de la oxidación del sustrato, ahora se sabe que las anhidrasas carbónicas son ubicuas, y ocurren en animales, plantas y varias bacterias. Diferentes enzimas de diferentes fuentes, que catalizan la misma reacción y suelen tener estructuras homólogas, se denominan isoenzimas. En ocasiones el mismo organismo tiene más de una isoenzima para una función particular, como es cierto para la anhidrasa carbónica humana.

El gas CO ₂ es relativamente soluble en agua (3 x 10 ^-2 M a temperatura ambiente bajo p _CO2 = 1 atm), equilibrándose con carbonato de hidrógeno a pK _a 6.1:

\[CO_{2} + H_{2}O \rightleftharpoons HCO_{3}^{-} + H^{-} \tag{2.6}\]

La reacción no catalizada es cinéticamente lenta alrededor del pH fisiológico (k\(\simeq\) 10 ^-1 s ^-1), mientras que, en presencia de la isoenzima más eficiente de CA, el número máximo de recambio de CO ₂ (es decir, el número de moléculas de sustrato transformadas por unidad de tiempo por cada molécula de enzima) ³³ es\(\simeq\) 10 ⁶ s ^-1. El ataque no catalizado por el agua sobre CO ₂ puede ser facilitado por dos moléculas de agua unidas por hidrógeno, una de las cuales activa el carbono por medio de un enlace de hidrógeno a un oxígeno de CO ₂ terminal, la otra de las cuales une el átomo de carbono vía oxígeno: ^34,35

\(\tag{2.7}\)

Solo por encima de pH 9 la reacción no catalizada se vuelve rápida, debido al ataque directo de OH ^-, que es un nucleófilo mucho mejor que H ₂ O (k\(\simeq\) 10 ⁴ M ^{-1 s -1}, donde M ^-1 se refiere a la concentración de OH ^-):

\[CO_{2} + OH^{-} \rightleftharpoons HCO_{3}^{-} \tag{2.8}\]

Por otro lado, la constante de velocidad en presencia de la enzima, llamada k _cat, es independiente del pH por encima de pH 8 en cada isoenzima CA (Figura 2.2). ^33,36

Figura 2.2 - Dependencia del pH de los valores k _cat y K _m para la hidratación de CO ₂ catalizada por las isoenzimas anhidrasa carbónica I, II y III. ^{33 ,36}

In vitro, la anhidrasa carbónica es bastante versátil, catalizando varias reacciones que involucran tanto OH ^- como H ⁺, como la hidrólisis de ésteres y la hidratación de aldehídos. Las diversas isoenzimas se han caracterizado con diferentes grados de sofisticación. Las formas de alta actividad se marcan II (k _cat\(\simeq\) 10 ⁶ s ^-1 a 25 °C); las formas de baja actividad I (k _cat\(\simeq\) 10 ⁵ s ^-1) y las formas de actividad muy baja III (k _cat\(\simeq\) 10 ³ s ^-1) ). ³⁷ La información estructural de rayos X a una resolución nominal de 2 Å está disponible para HCA I ³⁸ y HCA II, ³⁹ donde H indica humano. La estructura del HCA II ha sido refinada recientemente. Se reportan ⁴⁰ estructuras de alta resolución de mutantes y de sus derivados de sustrato e inhibidores. ²¹¹ Todas las isoenzimas son polipéptidos monocatenarios, con un peso molecular de aproximadamente 30 kDa y un ion zinc por molécula. Tienen la forma de una pelota de rugby con una grieta de 16 Å de profundidad que atraviesa el polo sur (Figura 2.3 Ver sección de placa de color, página C-2.). En la parte inferior de la grieta, el ion zinc está anclado a la proteína por tres átomos de nitrógeno de histidina y se expone al disolvente. Dos histidinas (His-94 e His-96, numeración HCA I) se unen al zinc a través de sus átomos de N\(\epsilon\) 2, mientras que una (His-119) se une a través de su átomo de N\(\delta\) 1 (Figura 2.4). Es bastante general que las histidinas se unan igualmente bien al zinc por cualquiera de los dos nitrógenos de histidina, siendo la preferencia probablemente dictada por las restricciones estéricas impuestas por el plegamiento proteico. Los tres protones NH de histidina están todos comprometidos en la unión H (Figura 2.4). La histidina-119 está involucrada en la unión de H con un residuo de glutamato. Como se mencionó, esta podría ser una forma de controlar la basicidad de los ligandos metálicos. Una molécula de disolvente unida al zinc está involucrada en un enlace H con Thr-199, que a su vez está unido por H a Glu-106. Esta red H-bonding es importante para comprender los sutiles cambios estructurales que ocurren con los cambios de pH; estos podrían, en principio, explicar las propiedades dependientes del pH. Aunque la estructura de los cristales cultivados a pH 8 en tampón que contiene sulfato da alguna indicación de una sola molécula de disolvente unida al zinc (Figuras 2.3 y 2.5 Ver sección de placa de color, páginas C2, C3.), estudios teóricos indican que dos moléculas de agua pueden estar a distancias de unión. ⁴² Tal hallazgo es consistente con estudios espectroscópicos sobre otras derivadas y con el concepto de que la unión y el desprendimiento de sustratos ocurren a través de cinco coordinaciones.

Figura 2.4 - Representación esquemática del sitio activo de la anhidrasa carbónica II humana. Se indican los enlaces de hidrógeno (—) y las moléculas de agua ordenadas (o). ⁴¹

Así como es cierto para cada enzima de zinc en la que el zinc se encuentra en el sitio catalítico, la actividad se pierde si se elimina el metal, y se restablece por la absorción de zinc. La estructura terciaria de la anhidrasa carbónica se mantiene en ausencia de zinc; incluso la apoproteína desnaturalizada puede replegarse espontáneamente de una espiral aleatoria a una conformación de tipo natural. Aunque dicho proceso es acelerado por el zinc, ^43,44 la presencia del metal no parece ser un requisito absoluto para el correcto plegamiento del CA, mientras que es un requisito absoluto para varias otras metaloproteínas. ^{23 ,29,30}

Los aniones son atraídos en la cavidad metálica por el resto positivo Zn (N ₃ OH ₂) ²⁺, y se cree que se unen al zinc en la anhidrasa carbónica de manera muy efectiva; por lo que su uso debe evitarse en la medida de lo posible si el objetivo es estudiar la enzima tal como es. Cuando la proteína se dializa contra agua recién doblemente destilada o cuidadosamente desionizada bajo una atmósfera inerte, el pH de la muestra se aproxima al punto isoeléctrico, que está por debajo de 6 para las enzimas HCA I y bovina (BCA II). El pH se puede ajustar entonces mediante adiciones apropiadas de NaOH. Todas las mediciones reportadas en la literatura realizadas en tampones acetato, fosfato, imidazol o tris sulfato se ven afectadas por la interferencia del anión con el ión metálico. Sin embargo, se pueden usar especies tampón que contienen aniones grandes como Hepes (ácido 4 [(2-hidroxietil) -l-piperazinil] etansulfónico), ⁴⁵ ya que estos aniones no ingresan a la cavidad.

Hay muchos indicios de que el zinc en la forma de CA de pH alto tiene cuatro coordenadas con un grupo OH en el cuarto sitio de coordinación. A pH bajo la enzima existe en una forma que contiene agua coordinada; el número de coordinación puede ser cuatro (una molécula de agua) o cinco (dos moléculas de agua). Por supuesto, la ocurrencia de las especies de pH bajo depende de los pK _a de los equilibrios ácido-base complejos.