2.12: Dependencia del pH de la Unión de Inhibidores

La facilidad con la que se pueden obtener espectros electrónicos proporciona una manera sencilla de determinar las constantes de afinidad de los inhibidores para las enzimas sustituidas con cobalto. Se diluye una alícuota de enzima en una célula espectrofotométrica hasta un volumen fijo, y se mide el espectro. Luego los espectros se vuelven a medir en muestras que contienen la misma cantidad de enzima más cantidades crecientes de inhibidor en el mismo volumen celular. El pH se controla rigurosamente. Si las soluciones de enzima e inhibidor tienen el mismo pH, el pH debe verificarse después de las mediciones espectrales, para evitar la contaminación del medio salino del electrodo. Tanto los valores absolutos como las dependencias de pH de las constantes de afinidad obtenidas de los espectros electrónicos son los mismos que los obtenidos de las mediciones de inhibición, donde se conocen, y son comparables a los obtenidos en la enzima nativa.

Aunque los valores constantes de afinidad reportados en la literatura se midieron bajo diferentes condiciones experimentales de, por ejemplo, pH, tipo de tampón y concentración de tampón, varias tendencias dependientes del pH son evidentes. De acuerdo con tales dependencias, se pueden identificar tres clases de inhibidores ⁴⁸ (Figura 2.15).

_{Figura 2.15 - Tipos de dependencias de pH observadas para las constantes de afinidad de inhibidores para anhidrasas carbónicas sustituidas con cobalto (II). pK a [E] representa el valor pK a principal de la enzima, pK a [I] el del inhibidor, si está presente.} ⁴⁸

En la primera clase, la constante de afinidad, expresada como log K, disminuye linealmente al aumentar el pH. Los aniones que son bases débiles de Lewis (Cl ^-, N ₃ ^-, CH ₃ COO ^-, NO ₃ ^-, etc.) se comportan de esta manera, al igual que los ligandos neutros como CH ₃ OH y anilina. Un ejemplo se muestra en la Figura 2.16. Se puede obtener un ajuste cualitativo a tales curvas usando un solo pK _a. Este comportamiento podría explicarse asumiendo que el ligando se une solo a la forma de pH bajo de la enzima, en un esquema simplificado en el que solo un pK _un valor determina la distribución de especies en CA. Sabemos, sin embargo, que el panorama es más complejo.

Figura 2.16: Dependencia del pH de las constantes de afinidad aparentes del nitrato para las anhidrasas carbónicas humanas I\(\blacksquare\) , II bovinas (▲) y II (•) humanas. Las curvas son curvas de mejor ajuste obtenidas asumiendo afinidad distinta de cero del anión para las especies I y 3 de la Figura 2.9. Los parámetros de mejor ajuste se reportan en el Cuadro 2.6. Los puntos entre paréntesis para HCA I reflejan la posible unión de un segundo ion nitrato y han sido excluidos del ajuste. ⁵⁷

Si se supone que la distribución de especies calculada de acuerdo con el esquema de la Figura 2.9 se mantiene, y si se asume que solo las dos especies que contienen agua (1) y (3) pueden unirse por el ligando, entonces se pueden evaluar las constantes de afinidad reales para ambas especies (1) y (3) ⁵⁷ (ver Tabla 2.7). _{Dichas constantes son similares para las tres isoenzimas, mientras que las constantes de afinidad aparentes a pH 7, por ejemplo, dependen principalmente de las pK a's del agua coordinada de acuerdo con los valores del Cuadro 2.5.} Por lo tanto, la especie de baja actividad CA I tiene mayor afinidad por aniones como nitrato (y bicarbonato) que las formas de alta actividad a pH 7.

Cuadro 2.7: Constantes de afinidad del nitrato para las especies 1 y 3a de anhidrasas carbónicas sustituidas con cobalto (II). ⁵⁷ * Como se define en la Figura 2.9

	HCA I	BCA II	HCA II
registro K 1	3.74 ± 0.04	4.01 ± 0.02	4.34 ± 0.04
registro K 3	2.62 ± 0.06	2.56 ± 0.04	2.61 ± 0.05

Un segundo tipo de comportamiento ocurre para ácidos débiles como HCN, H ₂ S y sulfonamidas aromáticas (ArSO ₂ NH ₂). ^76,77 Suponiendo que los aniones (bases conjugadas) se unen a las especies de pH bajo de la enzima, se puede explicar la gráfica en forma de campana de log K versus pH (Figura 2.15). De hecho, a pH bajo, los inhibidores están en la forma protonada, lo que no es adecuado para la unión a metales. A pH alto disminuye la concentración de las especies de pH bajo de la enzima. La afinidad aparente máxima se encuentra experimentalmente a medio camino entre el pK _a del inhibidor y el “pK _a" de la enzima, tratado como si fuera solo uno. También se espera el mismo tipo de curva si las especies de pH alto de la enzima se unen al ácido débil. De hecho, las mediciones cinéticas parecen favorecer esta hipótesis para las sulfonamidas. ⁷⁸

Se obtiene un tercer tipo de comportamiento para inhibidores como imidazol y triazoles, que unen la enzima con afinidades similares en un amplio rango de pH (Figura 2.15), ^79,80 debido a que tanto el anión imidazolato como el imidazol neutro pueden unirse a las formas aquo de la enzima con esencialmente el mismo afinidad, ^48,80,81 y la reacción del imidazol con la especie Zn-OH no puede distinguirse termodinámicamente de la reacción del imidazolato con las formas aquo:

Es posible que el nitrógeno no coordinado pueda interactuar con un grupo en la proteína a través de un enlace de hidrógeno. Un candidato podría ser el grupo NH de His-200 en HCA I o el grupo hidroxilo de Thr-200 en HCA II. En efecto, sólo el imidazol y los triazoles, que tienen dos nitrógenos en las posiciones 1,3-, parecen tener esta capacidad. ²¹³

En resumen, de la sustitución de cobalto hemos aprendido:

1. la geometría de coordinación de las formas de pH alto y bajo mediante espectroscopía electrónica;
2. los valores de pK _a partir de la dependencia del pH de los espectros electrónicos;
3. la coordinación cuatro y cinco de los diversos derivados con ligandos exógenos;
4. las constantes de afinidad de los ligandos exógenos y su dependencia del pH;
5. una huella digital en los espectros de RMN ^1H que se puede utilizar para monitorear variaciones estructurales.

La mayoría de estas conclusiones pueden transferirse de manera segura a la enzima nativa de zinc, aunque pueden ocurrir diferencias menores, por ejemplo, en la posición del equilibrio entre especies de cuatro y cinco coordenadas.