2.17: ¿Qué Aprendemos?

De Sustitución de Cobre

La química de coordinación del CuCa aún no se entiende completamente, ya que los espectros electrónicos no son muy sensibles al pH. Sin embargo, la afinidad de los aniones es dependiente del pH, como lo es para la CoCa. ⁸² Como se podría anticipar de la Sección III.B, la afinidad de los aniones, incluyendo HCO ₃ ^-, es mayor que la de CoCa. El agua suele estar presente en la esfera de coordinación, junto con el anión, como lo comprueba el agua ¹ H NMRD. ^83,84 Los requerimientos estéricos de las tres histidinas y de la cavidad permiten que el anión y la molécula de agua se dispongan en una geometría piramidal esencialmente cuadrada (Figura 2.17).

Figura 2.17 - Representación esquemática de la geometría de coordinación sugerida para los aductos aniónicos de CuCa.

Esto es consistente con los espectros electrónicos y EPR. En particular, los espectros de EPR son todos axiales, con valores g que disminuyen de 2.31 en la enzima no ligada a 2.24 en los diversos aductos aniónicos. ⁸⁴ La molécula de agua estaría en el sitio C o sitio de unión hidrófilo, y el anión estaría en el sitio B o bolsillo hidrófobo. Su 94 estaría en la posición apical de la pirámide cuadrada. Se ha demostrado por espectroscopia EPR que a baja temperatura dos aniones cianuro se unen al cobre. Los átomos donantes son dos átomos de carbono cianuro y dos átomos de nitrógeno de histidina en el plano basal, y el tercer nitrógeno de histidina en la posición axial. ⁸⁵ La división hiperfina se observa solo con núcleos en el plano basal. Se observa tanto con ¹³ núcleos C de ¹³ CN enriquecidos en C ^- como con los dos ¹⁴ N de dos histidinas. El segundo cianuro puede así desplazar el agua coordinada (Figura 2.17). El oxalato y las sulfonamidas desplazan el agua de la esfera de coordinación. ^85,86 Para el ion oxalato esto puede ocurrir a través del comportamiento bidentado. No se puede descartar la coordinación a un oxígeno de la sulfonamida, aunque los espectros electrónicos y EPR del complejo de sulfonamida son más consistentes con un cromóforo pseudotetraédrico. El resto SO ₂ en cualquier caso apuntaría hacia el sitio de unión B. Es probable que las sulfonamidas se unan como en ZnCa. El bicarbonato también muestra menos relajación hídrica que otros aniones monodentados. ^83,84.86

^La espectroscopia de RMN C se ha utilizado para investigar la ubicación de los dos sustratos, CO ₂ y HCO ₃, con respecto al ión metálico en CuCa. ^86-88 Como se señaló en la Sección IV.B, la interconversión entre las dos especies es lenta en la escala de tiempo de RMN en ausencia de catalizadores. Por lo tanto, se observan dos señales (Figuras 2.6 y 2.18). En presencia de la CoCa catalíticamente activa, solo se observa una señal a concentraciones enzimáticas adecuadas, y no se puede obtener información individual sobre la unión de CO2. ^89,90 En presencia de CuCA inactivo, se observan nuevamente dos señales, las cuales se amplían en diferentes grados.

Figura 2.18 - Representación esquemática de los espectros de RMN de ¹³ C del sistema CO _{2/HCO 3} ^- (A) en agua pura, (B) en presencia de CoCa, y (C) en presencia de CuCa. ⁵⁶

Para la señal HCO ₃ ^- los valores T ₂ ^-1 estimados a partir del ancho de línea son mucho mayores que T ₁ ^-1. Dado que la ecuación para T ₂ ^-1, análoga a la Ecuación (2.14), predeciría valores similares de T ₁ y T ₂, ^69,72 debe estar presente un ensanchamiento considerable debido al intercambio químico. De hecho, a diferencia de T _1p ^-1 (Ecuación 2.1l), T _2p ^-1 puede ser una función complicada del tiempo de intercambio\(\tau\) _M y del desplazamiento isotrópico,\(\Delta \omega\) _M,

\[T_{2p}^{-1} = \frac{f_{M}}{\tau_{M}} \frac{T_{2M}^{-2} + T_{2M}^{-1} \tau_{M}^{-1} + (\Delta \omega_{M})^{2}}{(T_{2M}^{-1} + \tau_{M}^{-1})^{2} + (\Delta \omega_{M})^{2}} \tag{2.15}\]

En la región de intercambio lento, es decir, cuando se observan dos señales separadas y el ensanchamiento se debe al intercambio,\(T_{2p}^{-1} = f_{M} \tau_{M}^{-1}\). Esta región se caracteriza por un marcado incremento en el ancho de línea con el aumento de la temperatura, como lo confirman las mediciones a 4 y 25 °C, por lo que T _2p da una medida directa de\(\tau\) _M. ⁵⁶ Los valores de ¹³ C T ₁ ^-1 de HCO ₃ ^- son consistentes con el bicarbonato unido al metal. La distancia Cu—C sería de 2.5 Å si el electrón desapareado estuviera completamente sobre el ión cobre, según se estimó usando la Ecuación (2.1) y un valor de\(\tau\) _c = 2.1 x 10 ^-9 s obtenido independientemente del agua ^1H NMRD. ⁸³ Esta distancia es demasiado corta para un bicarbonato coordinado; sin embargo, la deslocalización de electrones en el ligando de bicarbonato puede explicar una distancia calculada tan corta; la posibilidad de un tipo de ligadura bidentado no puede descartarse. La tasa de disociación, que es muy baja, explica por sí misma la falta de actividad del derivado.

Para CO ₂, se podría calcular una distancia carbono-cobre si se conocían las constantes de afinidad del sustrato para la proteína. Cuando el sitio de unión, en su caso, comienza a saturarse, el intercambio rápido con exceso de ligando (en este caso, CO ₂) disminuye el efecto paramagnético observado. A partir de este comportamiento, se puede estimar la constante de afinidad. Para CO ₂ el efecto paramagnético permaneció constante hasta 1 M CO ₂; es decir, la constante de afinidad es menor a 1 M ^-1. Esto significa que prácticamente no hay afinidad por el cobre; sin embargo, el efecto paramagnético es paradójicamente alto. ⁸⁸

Otra imagen viene analizando los datos de RMN en términos de un modelo difusivo puro. ⁸⁸ Aquí se ha utilizado la ecuación ⁹¹ de Hubbard:

\[T_{2p}^{-1} = N_{M} \left(\dfrac{\mu_{0}}{4 \pi}\right)^{2} \frac{8 \pi}{225} \frac{\gamma_{I}^{2} n_{e}^{2} \mu_{B}^{2} S(S+1)}{d(D_{N}+D_{M})} \bigg(13f(\omega_{S}, \tau_{D})+3f(\omega_{S}, \tau_{D})\bigg) \tag{2.16}\]

donde

\[f(\omega, \tau_{D}) = \frac{15}{2} I(u)\]

\[u = [\omega \tau_{D}]^{1/2}\]

\[I(u) = u^{-5} \{u^{2} - 2 + e^{-u}[(u^{2} - 2) \sin u + (u^{2} + 4u + 2) \cos u]\}\]

d es la distancia de aproximación más cercana, D _N y D _M son los coeficientes de difusión de las moléculas que contienen el núcleo bajo investigación, y\(\tau\) _D = 2d ²/(D _N + D _M). El efecto paramagnético experimental se puede reproducir con una concentración de CO ₂ dentro de la cavidad mucho mayor que la de la solución a granel. Este resultado indica que el sustrato no se une a un sitio específico, pero probablemente se une en la región hidrófoba. Tenga en cuenta que el CO ₂ es más soluble en solventes orgánicos que en agua.

El efecto de la cavidad es atraer CO ₂ por interacción ya sea con el ión metálico o con una parte hidrófoba de la propia cavidad. Pero la constante de afinidad es en cualquier caso menor de lo esperado a partir de la constante de Michaelis (ver Sección IV.B) medida en condiciones de estado estacionario, lo que indica que esta última no representa la constante de disociación del sistema enzima-CO ₂.

^{En resumen, la principal información referente al ciclo catalítico obtenido del derivado de cobre es la caracterización estructural y cinética de especies tanto de CO ₂ como de HCO ₃, cuando no están interconvertiéndose sino presentes dentro de la cavidad.} De esta manera tenemos pruebas adicionales de que HCO ₃ ^- está unido al metal y que el CO ₂ es atraído dentro de la cavidad ya sea por interacciones hidrofóbicas o por el ion metálico o ambos. Los datos obtenidos sobre la geometría alrededor del cobre son consistentes con los obtenidos en cobalto.

De las sustituciones de manganeso y cadmio

Se han realizado varios estudios sobre MNCA. Aunque CA no es la proteína para la que Mn (II) se ha utilizado más extensamente como sonda paramagnética para mapear sustratos e inhibidores dentro de la cavidad metálica, midiendo los valores T _^2M-1 de protones del inhibidor N-acetil-sulfanilamida, y asumiendo que las contribuciones dipolares son dominantes, los investigadores han mapeado la orientación del inhibidor dentro de la cavidad activa (Figura 2.19). ⁹² Esta orientación es consistente con los datos de rayos X sobre sulfonamidas de unión más fuerte. ^64-66 MnCA no está completamente inactivo. ¹³ Los estudios de RMN C de la interconversión\(\rightleftharpoons\) CO ₂ HCO ₃ ^- a pH 8.5 mostraron que la tasa de interconversión es de aproximadamente 4 por ciento la de la enzima nativa. ⁹³ Los valores T ₁ ^-1 y T ₂ ^-1 de H ¹³ CO ₃ ^- sugieren que el bicarbonato podría estar bidentado en el paso central del ciclo catalítico. ⁹³

Figura 2.19 - Dibujo esquemático de la disposición geométrica del inhibidor N-acetil-sulfanilamida en la cavidad activa de CA sustituido con manganeso (II), tal como se revela mediante espectroscopía de RMN ^1H. ⁹²

Los datos de ¹¹³ estudios de Cd que se han realizado en CdBCA II y CdhCA I son consistentes con el panorama general que se presenta aquí. ⁹⁴ Los desplazamientos químicos de ¹¹³ Cd son de hecho consistentes con un conjunto donante de tres nitrógenos y dos oxígenos. El derivado de cadmio (II) podría ser de cinco coordenadas con dos moléculas de agua, de acuerdo con la expectativa basada en que su radio iónico sea mayor que el del zinc (II). La señal de ¹¹³ Cd de CdBCA II en presencia de benceno-sulfonamida enriquecida en ¹⁵ N se divide en doblete debido al acoplamiento nitrógeno-cadmio (Figura 2.20). ⁹⁵ Este resultado proporciona evidencia directa de unión metal-nitrógeno en sulfonamidas, lo que ha sido confirmado por los datos de rayos X. ⁶⁵

Figura 2.20 - Espectros de RMN de ¹¹³ Cd de anhidrasa carbónica bovina II sustituida en CD en presencia de ¹⁵ inhibidores de bencenosulfonamida enriquecidos en N (A) o ¹⁴ enriquecidos en N (B). ⁹⁵