3.5: Proteínas de unión a iones de calcio extracelulares

La concentración de Ca ²⁺ en los fluidos extracelulares suele ser órdenes de magnitud mayor que las concentraciones intracelulares. En los fluidos corporales de mamíferos, la concentración de Ca ²⁺ “libre” se estima en 1.25 mM (Ca ²⁺ total es ~2.45 mM) con solo variaciones menores. ¹⁴⁰ Por lo tanto, esperaríamos que los iones Ca ²⁺ en los fluidos extracelulares tengan un papel muy diferente al del interior de las células. Para asegurar la unión de Ca ²⁺, los sitios de unión macromoleculares solo necesitan tener una afinidad modesta de Ca ^{2+ (K _B Ca2+} ≈ 10 ³ a 10 ⁴ M ^-1), y dado que el Ca ²⁺ extracelular no parece tener una función de señalización, el las tasas de asociación o disociación de Ca ²⁺ en los sitios de unión a proteínas no necesitan ser muy altas.

Un aspecto particularmente importante del Ca ²⁺ en mamíferos es su papel en el sistema de coagulación sanguínea. Aquí conoceremos un nuevo tipo de aminoácido,\(\gamma\) -ácido carboxiglutámico (“Gla”) -ver Figura 3.29, que parece haber sido diseñado por Nature como un ligando Ca ²⁺ con funciones bastante especiales. También se encuentran proteínas que contienen GLA en algunos tejidos mineralizados. La formación de huesos, dientes y otras estructuras duras calcificadas es un fenómeno intrigante y complicado que se tratará en la Sección VII. Comenzamos, sin embargo, con una breve discusión sobre el papel del Ca ²⁺ en algunas enzimas extracelulares.

Figura 3.29 - Estructuras químicas de dos nuevos aminoácidos que se cree que se unen al calcio en, por ejemplo, proteínas de coagulación sanguínea.

Ca ²⁺ -unión en algunas enzimas extracelulares

Varias enzimas extracelulares tienen uno o más iones Ca ²⁺ como partes integrales de su estructura. En muy pocos de ellos el ion Ca ²⁺ se une en o cerca de la hendidura activa, y parece necesario para mantener la actividad catalítica (fosfolipasa A ₂,\(\alpha\) -amilasa, nucleasas), mientras que otras enzimas muestran actividad catalítica incluso en ausencia de Ca ²⁺ (tripsina y otras serina proteasas). En estas últimas proteínas, al ion Ca ²⁺ se le suele atribuir un papel “estructural”, aunque su función puede estar más relacionada con la “dinámica” y por lo tanto ser más sutil y compleja.

La tripsina tiene un sitio de unión a Ca ^{2 +} con cuatro ligandos (dos oxígenos de cadena lateral y dos cadenas principales) donados por la proteína (Glu-70, Asn-72, Val-75 y Glu-80) y dos moléculas de agua ligantes, lo que hace que el sitio sea aproximadamente octaédrico. ¹⁴¹ Se ha medido la constante de unión de Ca ²⁺ a la tripsina y su precursor inactivo “proenzima”, el tripsinógeno (ver Cuadro 3.2). La constante de unión es ligeramente menor para el precursor, como también es cierto para la quimotripsina y el quimotripsinógeno. ¹⁴² Las afinidades de Ca ²⁺ de las serina proteasas y sus proenzimas son tales que sus sitios Ca ²⁺ estarán ocupados en gran parte en fluidos extracelulares, pero estarían desocupados dentro de una célula. Se ha sugerido que este fenómeno constituye una salvaguardia contra la conversión no deseada de las proenzimas en las enzimas activas siempre que aún estén dentro de las células donde se sintetizan.

Las tasas de disociación Ca ^{2 +} de las enzimas y proenzimas anteriores se han medido mediante técnicas de RMN de ⁴³ Ca y de flujo detenido, ¹⁴² y se recogen en la Tabla 3.4. Observamos que los valores de k _on y k _off son generalmente mucho menores que en las proteínas intracelulares reguladoras de la mano EF discutidas en la Sección VI. Mientras que estos últimos tienen propiedades dinámicas y de equilibrio similares a las de los quelantes flexibles de bajo peso molecular como EDTA y EGTA, las serina proteasas son más similares a los criptados más rígidos, como el aminocriptato macrobicíclico [2.2.2] (ver Tablas 3.2 y 3.4).

Como se mencionó anteriormente, existen algunas enzimas en las que un ion Ca ²⁺ está presente en la hendidura activa y esencial para la actividad. La fosfolipasa pancreática A ₂ (M _r ≈ 14 kDa) es una enzima de este tipo. Se sabe que la estructura de rayos X es de alta resolución, y se encuentra que un solo ion Ca ²⁺ está rodeado por seis ligandos, cuatro presentados por la proteína (Tyr-28, Glu-30, Glu-32 y Asp-49) y dos moléculas de agua. ¹⁴³ Se ha propuesto un mecanismo para la acción de la fosfolipasa A ₂ ¹⁴⁴ y se muestra en la Figura 3.30.

Figura amablemente proporcionada por P. B. Sigler.

Este mecanismo se basa en tres estructuras cristalinas de rayos X de alta resolución de fosfolipasa A ₂ con y sin análogos de estado de transición unidos. ^{La constante de unión para Ca 2+ junto con la tasa de disociación encontrada a partir de los estudios de RMN de Ca a temperatura variable 43 pueden usarse para calcular k _en ≈ 4 x 10 6 M -1 s -1, nuevamente menor que en las proteínas de la mano EF. Estudios recientes de RMN 1H indican que la estructura global de la lipasa es muy similar en las formas libres de Ca 2+ y unidas a Ca 2+.} Los cambios estructurales en la unión de Ca ²⁺ aparecen localizados principalmente en la región del sitio de unión. ^112,146

Las glándulas mamarias producen, entre otras sustancias, un activador enzimático de unión a Ca ²⁺, \(\alpha\)-lactalbúmina, que tiene aproximadamente 40 por ciento de identidad de secuencia con la lisozima. Esta proteína, que participa en la conversión de la glucosa en lactosa, se secreta en grandes cantidades, y en la leche humana constituye alrededor del 15 por ciento de la proteína total. La constante de unión a Ca ^{2 +} de\(\alpha\) lactalbúmina bovina o humana es del orden de 10 ⁷ M ^-1 bajo condiciones fisiológicas. Además de Ca ²⁺, la enzima también se une a Zn ²⁺. Parece que la unión de iones Ca ^{2 +} afecta la actividad enzimática, y de alguna manera controla el proceso de secreción, pero el papel biológico de la unión de iones metálicos a la a-lactoalbúmina necesita ser estudiado más a fondo. La estructura de rayos X de la a-lactoalbúmina de leche de babuino (M _r ≈ 15 kDa) se ha determinado ¹⁴⁷ a una alta resolución (~1.7 Å). El sitio de unión a Ca ²⁺ tiene una estructura interesante. El ion está rodeado por siete ligandos de oxígeno, tres de los grupos carboxilato de los residuos aspartilo (82, 87 y 88), dos oxígenos de carbonilo (79 y 84) y dos moléculas de agua. La disposición espacial es la de una bipirámide pentagonal ligeramente distorsionada con los oxígenos carbonílicos en los ápices, y los cinco ligandos donados por las proteínas forman parte de un giro apretado tipo “codo”. El sitio\(\alpha\) -lactoalbúmina tiene una similitud estructural superficial con una “mano EF”, aunque la enzima presumiblemente no tiene relación evolutiva con las proteínas reguladoras intracelulares de unión a Ca ²⁺.

La coagulación de la sangre procede en una complicada cascada de eventos vinculados que involucran muchas enzimas y proenzimas. Hace aproximadamente una década se demostró que varias de estas proteínas contenían un aminoácido previamente desconocido, el ácido\(\gamma\) -carboxiglutámico (Gla), y más recientemente se ha descubierto otro aminoácido nuevo, el ácido\(\beta\) -hidroxiaspártico (Hya) (ver Figura 3.29). El primero se forma postribosómicamente por un proceso dependiente de vitamina K en el hígado. ¹⁴⁸ Actualmente la proteína Gla más estudiada en el sistema de coagulación sanguínea es la protrombina (M _r ≈ 66 kDa). Diez residuos Gla se agrupan por pares en la región N-terminal, esencialmente alineando un borde de la molécula, formando una región altamente cargada negativamente. ¹⁴⁹ Se puede preparar un pequeño fragmento proteolítico (F1) (48 residuos) que contiene los diez aminoácidos Gla. La protrombina puede unirse a aproximadamente 10 iones Ca ²⁺, pero F1 se une solo a 7. Los estudios de unión a F1 muestran que los iones Ca ²⁺ se unen en tres sitios cooperativos de alta afinidad y cuatro sitios no interaccionantes, ¹⁵⁰ y que esta unión tiene lugar junto con un cambio conformacional detectable espectroscópicamente (ver Tabla 3.1).

En presencia de iones Ca ²⁺, la protrombina y otras proteínas dependientes de la vitamina K en el sistema de coagulación sanguínea se unirán a las membranas celulares que contienen fosfolípidos ácidos, en particular, la membrana plaquetaria, que es rica en fosfatidilserina. Un modelo propuesto para la interacción protrombina-membrana se muestra en la Figura 3.31.

Figura amablemente proporcionada por C. C. F. Blake

Desde hace tiempo se sabe que los iones de calcio están involucrados en las interacciones célula a célula y célula a matriz extracelular, pero los detalles moleculares en gran parte permanecen por desentrañar. A finales de la década de 1980 se caracterizó una gran glicoproteína de matriz adhesiva de unión a calcio (M _r ~ 420 kDa) llamada trombospondina. Esta molécula de adhesión multifuncional está compuesta por tres cadenas polipeptídicas, cada una con 38 repeticiones de Amino-ácido-IONG que son homólogas a los sitios hélice-bucle-hélice de unión a calcio de la superfamilia de calmodulina. ¹⁵² Se informa que cada molécula de trombospondina se une a 12 iones de calcio con una afinidad de aproximadamente 10 ⁴ M ^-1, y la eliminación del calcio va acompañada de un cambio conformacional. ^153,154