3.7: Transporte intracelular de iones de calcio

Con el fin de proporcionar una mejor comprensión del papel del Ca ²⁺ como un regulador casi universal de la función celular, necesitamos echar un breve vistazo a las muchas formas por las que los iones Ca ²⁺ pueden ser transportados dentro o fuera de las células eucariotas. Aunque se han dilucidado diversas vías de transporte, el panorama actual probablemente no esté completo, ya que las estructuras moleculares y propiedades de las proteínas transportadoras son solo parcialmente conocidas. Las principales vías para el transporte de Ca ²⁺ a través de las membranas celulares involucran tres sistemas de membrana: la membrana plasmática, la membrana mitocondrial interna y la membrana del retículo endoplásmico (ER) (o, en las células musculares estriadas, una forma especializada de ER llamada retículo sarcoplásmico (SR): ( Figura 3.9). Dos de los sistemas de transporte unidos a membrana son Ca ²⁺ -ATPasas, ya que derivan su energía principal de la hidrólisis de ATP (1 y 2 en la Figura 3.9). Sus propiedades, sin embargo, difieren en muchos otros aspectos, como veremos.

Figura 3.9 - Representación esquemática de las principales vías para el transporte de Ca ²⁺ a través de membranas celulares. PM: membrana plasmática; ER (SR), retículo endoplásmico (retículo sarcoplásmico); M, mitocondrias;\(\Delta \Psi\), diferencia en el potencial de membrana. Las proteínas de transporte mostradas son: 1 y 2, PM y ER (SR) Ca ²⁺ -ATPasas; 3 y 4, canales de Ca ²⁺ mediados por receptores PM y ER (SR); 5 y 6, PM y M (membrana interna) Na ⁺ /Ca ²⁺; 7 y 8, PM y M canales Ca ²⁺ sensibles al voltaje. Además, algunas vías de transporte “pasivas” no bien definidas se indican con flechas discontinuas.

El Ca ²⁺ -ATPasas

La membrana plasmática Ca ²⁺ -ATPasa (PM Ca ²⁺ -ATPasa) de los eritrocitos —reconocida por primera vez por Schatzmann en 1966 ⁴⁵ — fue aislada en forma pura por Niggli et al. en 1979, utilizando una columna de afinidad con una proteína de unión a ATP-asa, calmodulina (ver Sección V.A), acoplada al gel. ⁴⁶ Ca ²⁺ -ATPasas purificadas de otros tipos de membranas plasmáticas parecen ser muy similares. La estructura esquemática de la membrana eritrocitaria Ca ²⁺ -ATPasa se presenta en la Figura 3.10. ⁴⁷ El retículo sarcroplásmico en las células musculares es abundante en Ca ²⁺ - ATPasa. Se estima que esta proteína constituye más del 80 por ciento de las proteínas integrales de membrana, y cubre un tercio de la superficie.

Figura amablemente proporcionada por R. Moser y E. Carafoli.

El retículo sarcoplásmico Ca ²⁺ -ATPasa (SR Ca ²⁺ -ATPasa) se purificó por primera vez por MacLennan en 1970. ⁴⁸ Actualmente es la Ca ²⁺ -ATPasa mejor caracterizada. Un modelo esquemático y un resumen de algunas propiedades se dan en la Figura 3.11. ⁴⁹ Diez segmentos hidrófobos de aproximadamente 20 residuos de aminoácidos cada uno son revelados por gráficos de hidropatía, y se supone que estos segmentos abarcan la membrana como\(\alpha\) hélices. (Para los códigos de una letra para los aminoácidos, véase el Apéndice B en la Sección IX.) El sitio de fosforilación se ha identificado como Asp-351, y el dominio de unión a nucleótidos sigue al dominio de fosforilación. Los sitios de unión a Ca ²⁺ se localizan dentro de los dominios transmembrana predichos (ver Figura 3.11). Esto se demostró a través de una serie de mutaciones dirigidas al sitio en las que probablemente los residuos ligandadores de Ca ²⁺ como Asp, GiU y Thr se mutaron en residuos que carecían de posibles ligandos de cadena lateral (por ejemplo, Asn, GlN y Ala). ⁵⁰

Figura 3.11 - Estructura esquemática de la Ca ²⁺ -ATPasa del retículo sarcoplásmico. Algunas características moleculares son: M _r = 110,000; K _m < 1\(\mu\) M (dos sitios Ca ²⁺ en el lado citoplásmico en forma de alta afinidad); relación Ca ²⁺ /ATP, 2; Mg ²⁺ requerido para la actividad. Los residuos de aminoácidos marcados se mutaron a un residuo que carecía de cadenas laterales capaces de unirse a Ca ²⁺. Las mutaciones en las posiciones en círculo resultaron en la pérdida completa de la actividad de transporte de Ca ²⁺, lo que sugiere que los residuos en un círculo participan en la unión de Ca ²⁺. Adaptado de la Referencia 50.

El ciclo de reacción actualmente aceptado involucra dos conformaciones alternativas principales, _E1 y _E2, la primera con dos sitios de alta afinidad (K _m 1\(\mu\) M) ⁴ en el lado citoplásmico, que en E ₂ están abiertos al lado luminal con K _m ~ 1 mM. ^49,51 El mecanismo sugerido para el transporte de Ca ²⁺ (Figura 3.12) tiene muchas características similares a las sugeridas por Williams para la translocación H ⁺ en la ATPasa mitocondrial. ⁵²

Figura 3.12 - Ciclo de reacción esquemático simplificado de la Ca ²⁺ -ATPasa del retículo sarcoplásmico (SR). ^49,51 Se supone que la proteína de transporte está en cualquiera de dos estados, E ₁ en el lado citoplásmico, o E ₂ en el lado de la luz SR. Partiendo de _E1 en la esquina superior izquierda, los pasos de reacción mostrados son: (a) unión de Ca ²⁺ y ATP (constantes de disociación aproximadas entre paréntesis); (b) fosforilación rápida de Asp-351 de la proteína (_E1 ^-P) y liberación de ADP; (c) transformación _{de una conformación rica en energía, alta CA ²⁺ -afinidad (E ^1-P) (Ca ²⁺) 2 a una conformación de baja energía y baja afinidad (E ^2-P) (Ca ²⁺) 2; (d) hidrólisis de la proteína fosforilada y} liberación del fosfato en el lumen; (e) retorno al estado original.

Es instructivo considerar brevemente los límites termodinámicos del transporte. (Las discusiones sobre la termodinámica detrás del transporte de Ca ²⁺ /Na ⁺ se refieren también a gradientes de Na ^{+ /K +} en tejidos excitables). Definamos un “interior” y un “exterior” separados por una membrana, como se muestra en la Figura 3.13, donde [Ca ²⁺] y\(\psi\) denotan actividades y potenciales de membrana, respectivamente. La diferencia en el potencial electroquímico,\(\Delta \mu\), a través de la membrana para un ion Ca ²⁺ viene dada por

\[\Delta \mu_{Ca^{2+}} = + RT ln\frac{[Ca^{2+}]_{o}}{[Ca^{2+}]_{i}} + 2F \Delta \psi \tag{3.4}\]

donde F es la constante de Faraday, T la temperatura y R la constante de gas. Si asumimos\(\Delta \Psi\) = 0, lo que parece razonable para la membrana SR según evidencia experimental, podemos calcular el cambio de energía libre,\(\Delta\) G, a 25 °C para transferir\(\Delta\) n moles de Ca ²⁺ a través de la membrana. Esto se convierte en\(\Delta\) G = -\(\Delta\) n x\(\Delta \mu\) _{Ca ²⁺} =\(\Delta\) n x 4.1 kcal/mol si [Ca ²⁺] _o/[Ca ²⁺] _j = 10 ^-3 y\(\Delta\) G =\(\Delta\) n x 5.4 kcal/mol si [Ca ²⁺] _o/[Ca ²⁺] _j = 10 ^-4. Bajo las condiciones celulares pertinentes, el cambio de energía libre asociado con la hidrólisis de ATP a ADP y P _i ha sido calculado por Tanford para ser\(\Delta\) G = -13 a -14 kcal/mol. ⁵³ En ausencia de potencial de membrana, es así posible transportar dos iones Ca ²⁺ por cada molécula de ATP hidrolizada contra un gradiente de concentración (o actividad) de 10 ⁴ o más. Este tratamiento no dice nada, por supuesto, sobre los detalles moleculares de este transporte. Tanford ha propuesto un modelo más detallado para el ciclo de transporte. ⁵³

Figura 3.13 - Representación esquemática del transporte de Ca ²⁺ a través de una membrana por una molécula de Ca ²⁺ -ATPasa. \(\Psi\)denota potenciales de membrana.

En las células especializadas del tejido muscular, el retículo sarcoplásmico puede contener mucho calcio, y si todas fueran Ca ²⁺ “libres”, la concentración podría ser tan alta como 30 mM. ⁵⁴ Este valor provocaría una diferencia de presión osmótica a través de la membrana, así como pondría una alta demanda en la SR Ca ²⁺ -ATPasa. Una disminución de la concentración libre de Ca ²⁺ dentro de la SR sería claramente beneficiosa. En presencia de iones oxalato o fosfato en el medio externo, el oxalato o fosfato de calcio puede precipitar dentro del retículo sarcoplásmico, pero en circunstancias normales parece que los iones Ca ²⁺ dentro de la SR están unidos a una proteína muy ácida, la calsequestrina. ⁵⁴ Cada molécula (M _r ≈ 40 kDa) es capaz de unir 40 a 50 iones Ca ²⁺ con una constante de disociación efectiva de aproximadamente 1 mM (a I = 0.1). La proteína tiene una baja especificidad catiónica y se comporta en muchos aspectos como un polielectrolito cargado negativamente. Se ha cristalizado ⁵⁵ y es posible que pronto tengamos acceso a su estructura de rayos X.

El intercambiador Na ⁺ /Ca ²⁺ de la membrana plasmática

La información actualmente disponible sobre el intercambiador Na ⁺ /Ca ²⁺ se ha obtenido principalmente de estudios de las células grandes del axón del calamar gigante y de vesículas plasma-membrana de varios otros tejidos. ^56,57 En vesículas de membrana plasmática cardíaca, el intercambiador presenta las siguientes características: K _m = 1.5-5\(\mu\) M para Ca ²⁺ y ~20 nM para Na ⁺; V _max ≈ 20 nmol Ca ²⁺ /mg de proteína. ⁵⁸ La estequiometría es de al menos 3:1 Na ⁺ /Ca ²⁺. Muy pocos detalles moleculares del intercambiador están disponibles en la actualidad. Podemos volver a considerar brevemente el marco termodinámico para un intercambiador Na ⁺ /Ca ²⁺ (Figura 3. 14). La diferencia en el potencial electroquímico para Na y Ca ²⁺ a través de la membrana es:

\[\Delta \mu_{Ca^{2+}} = RT ln\frac{[Ca^{2+}]_{o}}{[Ca^{2+}]_{i}} + 2F \Delta \Psi, \tag{3.5}\]

\[\Delta \mu_{Na^{+}} = RT ln\frac{[Na^{+}]_{o}}{[Na^{+}]_{i}} + F \Delta \Psi \ldotp \tag{3.6}\]

Figura 3.14 - Representación esquemática del intercambiador Ca ²⁺ /Na ⁺ de la membrana plasmática. \(\Psi\)denota potenciales de membrana.

El cambio de energía libre,\(\Delta\) G _t ^Ca2+, asociado con una transferencia de\(\Delta\) n _{Ca ²⁺} moles de Ca ²⁺ desde el interior hacia el exterior es\(\Delta\) G _t ^Ca2+ =\(\Delta\) n _{Ca ²⁺} x \(\Delta \mu\)_{Ca ²⁺}, y el cambio correspondiente asociado con el movimiento de\(\Delta\) n _{Na ⁺} moles de Na ⁺ desde el exterior adentro es\(\Delta\) G _t ^{N a+} = -\(\Delta\) n _{Na ⁺} x\(\Delta \mu\) _{Na ⁺}. Si estos cambios de energía libre se acoplan a través del intercambiador, habrá un flujo neto de Ca ²⁺ siempre que la diferencia de energía libre,

\[\Delta \Delta G = \Delta G_{t}^{Ca^{2+}} - \Delta G_{t}^{Na^{+}} = \Delta n_{Ca^{2+}} \times \Delta \mu_{Ca^{2+}} - \Delta n_{Na^{+}} \times \Delta \mu_{Na^{+}}, \tag{3.7}\]

es menor que cero. Podemos escribir\(\Delta \Delta\) G para el transporte de 1 mol Ca ²⁺ como

\[\Delta \Delta G = 2.303 RT \bigg[ log\frac{[Ca^{2+}]_{o}}{[Ca^{2+}]_{i}} - \Delta n_{Na^{+}} \times log\frac{[Na^{+}]_{o}}{[Na^{+}]_{i}} \bigg] + (2 - \Delta n_{Na^{+}}) \times F \Delta \Psi \ldotp \tag{3.8}\]

Equiparando las actividades iónicas con las concentraciones, observamos que en una célula típica de mamífero [Na ⁺] _o ≈ 110-145 mM, y [Na ⁺] _i ≈ 7-15 mM, o [Na ⁺] _o/[Na ⁺] _i ≈ 10. En ausencia de una diferencia de potencial de membrana (\(\Delta \Psi\)= 0), la Ecuación (3.8) puede simplificarse a

\[\Delta \Delta G = 2.3 RT \bigg[ log\frac{[Ca^{2+}]_{o}}{[Ca^{2+}]_{i}} - \Delta n_{Na^{+}} \bigg] \ldotp \tag{3.9}\]

Para bombear un ion Ca ²⁺ fuera de una célula contra un gradiente de concentración de aproximadamente 10 ³ (1\(\mu\) M → 1 mM) requiere que al menos 3 iones Na ⁺ pasen en la dirección opuesta, manteniendo así\(\Delta \Delta\) G < O. Cuál será entonces el efecto de una diferencia de potencial de membrana ? La mayoría de las células animales, particularmente las células excitables como las células nerviosas y musculares, tienen diferencias de potencial en reposo\(\Delta \Psi\), sobre la membrana plasmática de 30 a 90 mV (citoplasma negativo). Por este valor encontramos el cambio en la energía libre,\(\Delta \Delta\) G, para que el transporte de un mol Ca ²⁺ sea

\[\Delta \Delta G = 2.3 RT \bigg[ log\frac{[Ca^{2+}]_{o}}{[Ca^{2+}]_{i}} - \Delta n_{Na^{+}} \bigg] + (2 - \Delta n_{Na^{+}}) 0.1 F \ldotp \tag{3.10}\]

Así para\(\Delta\) n _{Na ⁺} > 2, tenemos\(\Delta \Delta\) G < 0, y se promoverá el transporte de Ca ²⁺ contra un gradiente de concentración de aproximadamente 10 ³. Esta es otra buena razón para tener una estequiometría de intercambio Na ⁺ /Ca ²⁺ de 3:1.