3.15: Troponina C

La contracción del músculo estriado es desencadenada por iones Ca ²⁺. Las células musculares son altamente especializadas y contienen dos tipos de filamentos que pueden deslizarse entre sí en un proceso que consume energía. Uno de los filamentos, el filamento delgado, está formado por moléculas de actina (M _r ≈ 42 kDa) polimerizadas de extremo a extremo en una doble hélice. En los surcos de esta hélice corre una molécula larga parecida a una vara, la tropomiosina; y localizada sobre esta molécula a cada séptima actina, se encuentra un complejo de tres proteínas, la troponina. Las tres proteínas en el complejo de troponina son la troponina I (TnI), la troponina T (TnT) y la troponina C (TnC). En la Figura 3.20 se muestra una imagen esquemática de la organización del filamento delgado.

Figura 3.20 - Diagrama esquemático de la organización del filamento delgado del músculo esquelético, mostrando la posición de tropo-miosina y el complejo de troponina sobre el filamento de actina. La unión de Ca ²⁺ a TnC, la subunidad de unión a calcio del complejo de troponina, elimina TnI, la subunidad inhibidora, de la actina y así permite una interacción con una proteína especializada, la miosina, en filamentos musculares gruesos vecinos (no mostrados). Un cambio de conformación impulsado por el ATP en el grupo de cabeza de miosina hace que los filamentos gruesos y delgados se muevan uno con relación al otro, de modo que se produce la contracción muscular.

La troponina C es la subunidad de unión a Ca ² de la troponina, y es estructuralmente altamente homóloga a la calmodulina. La troponina C del músculo esquelético (sTNC; M _r ≈ 18 kDa) puede unir cuatro iones Ca ²⁺, pero la troponina C del músculo cardiaco (cTnC) tiene uno de los cuatro sitios de calcio modificados, de manera que se une solo a tres iones Ca ²⁺. Las estructuras de rayos X del sTNC del músculo esquelético de pavo y pollo se han determinado a resoluciones de 2.8 y 3.0 Å, respectivamente. ^102,103 La estructura del sTNC de pavo se muestra en la Figura 3.21.

Figura 3.17).

La similitud entre las estructuras de CaM (Figura 3.17) y sTNC es obvia. En sTNC nuevamente encontramos dos dominios, cada uno con dos sitios potenciales de Ca ²⁺, separados por una\(\alpha\) hélice de 9 vueltas. Los cristales se cultivaron en presencia de Ca ²⁺ a pH bajo (pH = 5), y solo dos iones Ca ²⁺ se encuentran en el dominio C-terminal. Los dos sitios de unión a Ca ²⁺ en este dominio tienen el mismo motivo hélice-bucle-hélice que se encuentra en CaM, y ambos se ajustan a la estructura arquetípica de la mano EF. Los ángulos interhélices entre las hélices E y F y entre G y H son cercanos a 110°. Por el contrario, las hélices en el dominio N-terminal, donde no se unen iones Ca ²⁺, están más cerca de ser antiparalelas, con ángulos interhélices de 133° (hélices A y B) y 151° (hélices C y D).

Tanto sTNC como cTnC tienen dos sitios de unión a Ca ²⁺ de alta afinidad (ver Tabla 3.2) que también unen iones Mg ²⁺ de manera competitiva, aunque con una afinidad mucho menor. Estos dos sitios suelen llamarse "los sitios Ca ²⁺ -Mg ²⁺”. 76,104 En sTNC también hay dos (en cTnC, solo uno) sitios de unión a Ca ²⁺ de menor afinidad (K _B ^Ca2+ ≈ 105 M ^-1) que se unen débilmente a Mg ²⁺ y por lo tanto han sido llamados "los sitios específicos de Ca ²⁺”. Dado que la unión de Ca ²⁺ a estos últimos sitios se supone que es el paso crucial en el evento contráctil, a menudo se les conoce como "los sitios reguladores" (ver más abajo). También se ha inferido la existencia de sitios Mg ²⁺ débiles adicionales (K _B ≈ 300 M ^-1) en el sTNC, no en competencia directa con Ca ²⁺. ^76,104,105 Estudios espectroscópicos han demostrado que los dos sitios fuertes de Ca ²⁺ - Mg ²⁺ se localizan en el dominio C-terminal, y los sitios específicos de Ca ²⁺ más débiles en el dominio N-terminal de sTNC. ¹⁰⁶ Este patrón es similar al observado con CaM. Los estudios espectroscópicos de RMN sugieren fuertemente que la unión de Ca ^{2 +} tanto a sTNC como a cTnC es cooperativa. ¹⁰⁷ En sTNC el dominio C-terminal se une a Mg ²⁺ mucho más fuertemente que el dominio N-terminal, en contraste con CaM, donde lo contrario es cierto.

Las tasas de disociación de Ca ²⁺ y Mg ²⁺ del sTNC se han medido mediante técnicas de flujo detenido y ⁴³ Ca NMR. ^76,108 Al igual que con CaM, los números reales dependen de las condiciones de la solución, fuerza iónica, presencia de Mg ²⁺, etc. (ver Cuadro 3.4). Sobre la tasa de disociación de Mg ²⁺ de los sitios Ca ^{2+ - Mg 2+}, se han obtenido resultados muy diferentes mediante estudios de flujo detenido ⁷⁶ de sTNC marcado con fluorescencia (k _off ^Mg2+ ≈ 8 s ^-1) y por ²⁵ Mg RMN (k _de ^Mg2+\(\simeq\) 800-1000 s ^-1). ¹⁰⁹ Esta aparente discrepancia parece haber sido resuelta por la observación de que tanto la unión como la liberación de iones Mg ²⁺ a los sitios Ca ²⁺ -Mg ²⁺ ocurren paso a paso, con k _fuera de ^Mg2+ < 20 s ^-1 para uno de los iones, y k _off ^Mg2+ ≥ 800 s ^-1 para el otro. ¹¹⁰ Las tasas de disociación de los iones Mg ²⁺ son importantes, ya que en condiciones fisiológicas es probable que los sitios Ca ^{2+ -Mg 2+} del sTNC estén predominantemente ocupados por iones Mg ²⁺, cuya liberación determina la velocidad a la que Ca ²⁺ puede entrar en estos sitios.

Los datos espectroscópicos y bioquímicos ¹¹¹ indican que al unirse a Ca ²⁺, sTNC y cTnC experimentan cambios significativos en la conformación. Las comparaciones de los cambios espectroscópicos de RMN en la unión de Ca ²⁺ a sTNC intacto, así como a los dos fragmentos producidos por escisión tríptica (esencialmente las mitades N-terminal y C-terminal de la molécula, tal como fue el caso con CaM), han demostrado que los cambios de conformación inducidos son principalmente localizado dentro del dominio que se une a iones añadidos. ^110,112 Así, la\(\alpha\) hélice central que conecta los dominios parece incapaz de propagar cambios estructurales de un dominio a otro. Se ha sugerido que las diferencias estructurales encontradas en la estructura de rayos X del sTNC de pavo entre el dominio C-terminal, que en el cristal contiene dos iones Ca ²⁺ unidos, y el dominio N-terminal, en el que no se encontraron iones Ca ²⁺, pueden representar estos cambios conformacionales. ¹¹³ Este cambio conformacional bastante sustancial se representa esquemáticamente en la Figura 3.22.

Figura amablemente proporcionada por N. C. J. Strynadka y M. N. G. James.

Sin embargo, los cálculos preliminares de la estructura ¹¹⁴ de las formas saturadas de calcio y libres de calcio de la calbindina D _9k indican que se producen cambios conformacionales mucho más sutiles al unir Ca ²⁺ en la calbindina D _9k. Curiosamente, la espectroscopia de RMN ^1H ha proporcionado evidencia para el concepto de que el cambio estructural inducido por la unión de Mg ²⁺ al dominio C-terminal del sTNC debe ser muy similar al inducido por los iones Ca ²⁺. Otro resultado obtenido por ¹¹³ estudios de RMN Cd ¹⁰⁸ es que el dominio N-terminal cargado de cadmio de sTNC en solución experimenta un rápido intercambio entre dos o más conformaciones, con un tipo de cambio del orden de 10 ³ -10 ⁴ s ^-1.

Así como CaM ejerce su función biológica en complejos con otras proteínas, TnC participa en el complejo de troponina de tres proteínas. Actualmente parece que TnC y TnI forman un complejo primario que está anclado por TnT a un sitio de unión en la tropomiosina. ¹¹⁵ En el complejo de troponina la afinidad de Ca ²⁺ se incrementa en un factor de aproximadamente diez sobre la del sTNC aislado, tanto en los sitios Ca ²⁺ -Mg ²⁺ como en los sitios específicos de Ca ²⁺. Un incremento similar en la afinidad se encuentra para Mg ²⁺. Dadas las cantidades de Mg ²⁺ “libre” dentro de las células musculares (1 a 3 mM), parece probable que los sitios Ca ²⁺ -Mg ²⁺ en estado de reposo de la troponina estén llenos de Mg ²⁺, de manera que una liberación transitoria de Ca ²⁺ conduce principalmente a Ca ² rápido ⁺ unión a los sitios específicos de Ca ²⁺, y posteriormente a cambio de conformación y contracción.