7.9: Enzimas redox multisitio (Parte 5)

Las Nitrogenasas Alternativas

1. Nitrogenasa de vanadio

La “esencialidad” del molibdeno para la fijación de nitrógeno fue reportada por primera vez por Bortels en 1930. ³⁰⁸ Este hallazgo condujo en última instancia a la caracterización de las nitrogenasas de molibdeno discutidas en la sección anterior. La obra de Bortels ha sido citada muchas veces, y a menudo se la menciona sin citación. Después de este trabajo seminal, posteriormente se buscaron y encontraron muchas otras enzimas que contenían MO. ^25,309 En la actualidad se conocen más de una docena de enzimas Mo distintas, y continuamente se descubren nuevas.

Además del clásico artículo de 1930, Bortels ³¹⁰ reportó en 1935 que el vanadio estimuló la fijación de nitrógeno. A diferencia del artículo de 1930, el de 1935 languideció en la oscuridad. Entonces, a partir de la década de 1970, se intentó aislar una nitrogenasa de vanadio. En 1971, dos grupos reportaron aislar una nitrogenasa que contenía vanadio de A. vinelandii. ^311,312 La interesante noción en este momento era que V podría sustituir al Mo en la nitrogenasa, no que hubiera un sistema separado. Se reportó que la enzima aislada era similar a la enzima Mo, pero tuvo una menor actividad y una especificidad de sustrato alterada. Uno de los grupos reinvestigó cuidadosamente su preparación, y encontró pequeñas cantidades de molibdeno, que se presumieron suficientes para dar cuenta de la baja actividad, aunque no se abordó la selectividad alterada. ³¹³ Se sugirió que el vanadio desempeñara un papel estabilizador para [FeMo], permitiendo aislar eficazmente la pequeña cantidad de proteína activa que contiene MO. Al parecer no se consideró la posibilidad de que existiera un sistema de nitrogenasa verdaderamente alternativo, cuyos centros proteicos y metálicos diferían ambos del de la nitrogenasa Mo.

La esencialidad única del molibdeno para la fijación de nitrogenasa no se desafió hasta 1980, cuando se demostró ³¹⁴ que se pudo observar un sistema alternativo de fijación de nitrógeno en A. vinelandii cuando este organismo estaba hambriento de molibdeno. ³¹⁵ A pesar del escepticismo de la comunidad investigadora de nitrogenasas, finalmente se demostró que incluso en un mutante del que se habían eliminado los genes estructurales de las proteínas de nitrogenasa de Mo (nif H, D y K), el sistema alternativo fue provocado por la inanición de Mo. En 1986, dos grupos ^316-321 aislaron las proteínas componentes alternativas de nitrogenasa de diferentes especies de Azotobacter, y demostraron inequívocamente que un componente contenía vanadio y que ninguno de los componentes contenía molibdeno.

Uno de los dos componentes del sistema V-nitrogenasa es extremadamente similar a la proteína Fe de la nitrogenasa. Esta similitud es evidente en las proteínas aisladas de A. vinelandii ³¹⁶ y en la homología genética entre nif H (el gen que codifica la subunidad de la proteína Fe en el sistema MO-nitrogenasa) y nif H* (el gen correspondiente en el sistema basado en V). Ambas proteínas Fe tienen una estructura de\(\alpha_{2}\) subunidad, y contienen un solo grupo Fe _{4 S 4} que es activo en EPR en su estado reducido.

Las proteínas FeV de Azotobacter vinelandii y Azotobacter chroococcum tienen cada una estructura de\(\alpha_{2} \beta_{2} \delta_{2}\) subunidades. ³²² La composición del metal y las comparaciones espectroscópicas entre las proteínas FeMo y FeV se muestran en la Tabla 7.9. Aunque existe la mayor diferencia que implica la presencia de V en lugar de Mo en la proteína FeV y en la probable presencia de las\(\delta\) subunidades pequeñas (13 kDa), los dos sistemas de nitrogenasa son por lo demás bastante similares. ³²² En cada una, un sistema de dos proteínas altamente sensibles al oxígeno lleva a cabo una reducción de N ₂ dependiente de ATP con evolución concomitante de H ₂. Las proteínas Fe tienen la misma estructura de subunidades y contenido de conglomerados, y son espectroscópicamente muy similares. Las versiones V de la proteína más grande tienen pesos moleculares algo más bajos que sus análogos de Mo, y por espectroscopia MCD parecen contener grupos similares a P. ³¹⁸ El sitio FeV aún puede ser un\(\frac{3}{2}\) centro S = (por EPR, aunque su EPR difiere significativamente de la del centro FeMo). ³²³ Las distancias V-S y V-Fe medidas por EXAFS ^324,325 son similares a las de los racimos de tiocubanes VFe ₃ S ₄ y a las distancias Mo-S y Mo-Fe como las de [FeMo], que a su vez son similares a las de los tiocubanes MoFe ₃ S ₄. De igual manera, XANES ^324,325 indica la coordinación tipo VS _{3 O 3} en [FeV] nitrogenasa similar a la coordinación de _{MoS 3 O 3} sugerida por XANES para FemoCO. El “cofactor FeV” es extraíble en NMF, y puede reconstituir el mutante nif B ^-, Femoco deficiente del sistema Mo. ³²⁶ A pesar de la sustitución de V por Mo, las proteínas y sus respectivos sitios M-Fe-S no difieren drásticamente. Sin embargo, los cambios en la composición se correlacionan con la reactividad alterada del sustrato.

Una diferencia importante entre las enzimas V y Mo radica en la especificidad del sustrato y la formación del producto. ³²¹ Como se muestra claramente en el Cuadro 7.9, la nitrogenasa de FeV tiene una reactividad mucho menor hacia el acetileno que el sistema Mo. Además, mientras que el sistema FeMo produce exclusivamente etileno a partir de acetileno, el sistema FeV produce cantidades significativas del producto de reducción de cuatro electrones, etano. ³²¹ La detección de etano en el ensayo de acetileno puede ser una técnica poderosa para detectar la presencia de la V nitrogenasa en sistemas naturales. ³²² Además, este patrón de reactividad se encuentra en el mutante nif B ^- reconstituido con FevCo, lo que indica que el patrón es característico del cofactor y no de la proteína. ³²⁶ El cambio de reactividad al pasar de Mo a V en sistemas proteicos similares agrega claramente peso a la implicación del centro M-Fe-S (M = V o Mo) en la reducción del sustrato.

Cuadro 7.9 - Comparación de proteínas nitrogenasas alternativas ^a

a) Av1 es la proteína FeMo de Azotobacter vinelandii, Av1* es la proteína FeV de A. vinelandii y Ac1* es la proteína FeV de A. chroococcum. Datos de las Referencias 317, 377 y 319, respectivamente.

b) Átomos por molécula.

c) nmol producto/min/mg de proteína.

Propiedad	Av1 ^47	Av1* ^47	Ac1* ^50
Peso molecular	240,000	200,000	210,000
Molibdeno ^b	2	< 0.05	< 0.06
Vanadio ^b	—	0.7	2
Hierro ^b	30-32	9.3	23
Actividad ^c
H ^+	2200	1400	1350
C 2 H 2	2000	220	608
N 2	520	330	350
Valores de g de EPR	4.3	5.31	5.6
	3.7	4.34	4.35
	2.01	2.04	3.77
		1.93	1.93

2. La nitrogenasa ³²² completamente de hierro

El primer indicio de que nuevamente existe otra nitrogenasa alternativa provino de estudios genéticos. Se construyó un mutante de A. vinelandii con deleciones tanto en nif HDK como en nif H*D*K*, es decir, los genes estructurales para las nitrogenasas Mo y V, respectivamente. A pesar de carecer de la capacidad de producir las dos nitrogenasas conocidas, la cepa mutante, sin embargo, pudo fijar el nitrógeno, aunque mal. Además, la actividad nitrogenasa de esta cepa mutante se inhibió claramente cuando Mo o V estaban presentes en el medio de cultivo. Estudios preliminares indican que las proteínas nitrogenasas producidas por este organismo están estrechamente relacionadas con las previamente aisladas. Se produjo una proteína 4Fe-4S Fe-F H ^\(\dagger\)y una proteína debida a nif D. ^\(\dagger\) Este último parecía no contener más metal estequiométrico que el hierro. La simetría de la nomenclatura sugeriría llamar a esta proteína FeFe y su cofactor FeFeCo. Curiosamente, esta nitrogenasa parece ser la más pobre del conjunto en reducir N ₂ y hace etano a partir de etileno. El hallazgo de la nitrogenasa totalmente de hierro, si se confirma completamente, se sumará significativamente a la bioquímica comparativa de la fijación de nitrógeno. De manera especulativa, se podría sugerir que la ausencia concomitante de V y Mo sugiere que la fijación de nitrógeno no necesita involucrar directamente al heterometal no irón en el cúmulo de cofactores. Este resultado puede explicar la falta de implicación directa del Mo en el mecanismo de fijación de nitrógeno, a pesar de muchos años de intenso esfuerzo por parte de los trabajadores en el campo. (La discusión anterior debe tomarse cum grana salis hasta que se confirme la existencia de la nitrogenasa totalmente de hierro).

3. Sistemas Modelo

Se pueden considerar tres tipos de sistemas modelo para la nitrogenasa. Primero, hay conglomerados de sulfuro de metal de transición que se asemejan a los centros FemoCO o FEVCO de las proteínas activas. Si bien ha habido avances significativos, todavía no hay modelos definitivos (como los hay para Fe ₂ S ₂ y Fe ₄ S ₄). Un segundo enfoque utiliza las reacciones de N ₂ y sustratos o intermedios relacionados con centros metálicos para obtener información sobre la manera en que los sistemas de metales de transición unen N ₂ y lo activan hacia la reducción. Aquí hasta la fecha los sistemas más reactivos tienen poco parecido químico directo con los sitios activos de la nitrogenasa. Sin embargo, estos sistemas llevan a cabo una fijación de nitrógeno de buena fe a partir de la cual se pueden aprender las diversas formas en que se puede activar el N ₂. Finalmente, existen otros sistemas inorgánicos que muestran algunas de las características estructurales y posiblemente algunas de las características de reactividad de los sitios activos de la nitrogenasa sin unirse o reducir N ₂ o imitar con precisión el centro activo. Sin embargo, es posible que podamos aprender de manera efectiva sobre la reactividad de la nitrogenasa a partir de estos interesantes sistemas químicos.

a. Modelos de sulfuro de metales de transición para sitios de nitrogenasa

Si bien ha habido una gran actividad en la química de conglomerados Fe-S sintéticos, hasta la fecha no existe ningún ejemplo de un modelo espectroscópico para los sitios del racimo P en la nitrogenasa. Si los clústeres P son de hecho agrupamientos Fe _{4 S 4} de alto giro unidos asimétricamente, entonces el trabajo reciente en versiones de alto giro de los clústeres ³²⁷ de Fe _{4 S 4} y centros ¹⁴³ de Fe _{4 S 4} derivatizados selectivamente en el sitio puede indicar que se acercan sistemas modelo apropiados.

b. Modelos de Cluster Fe-M-S para FemoCo

A pesar de la importancia de los grupos P, el modelado del centro FemoCo ha recibido adecuadamente la mayor atención. Los parámetros estructurales significativos que cualquier modelo debe duplicar son las distancias Mo-S y Mo-Fe determinadas por EXAFS. Espectroscópicamente, la señal S =\(\frac{3}{2}\) EPR proporciona una característica estricta que los sistemas modelo deben aspirar a imitar.

Se han preparado muchos clusters de Femos en la búsqueda de duplicar el centro FemoCO, pero ninguno de los clusters sintetizados químicamente puede reactivar los mutantes sin cofactores (UW-45 o Nif B ^-), quizás por su falta de homocitrato, que solo recientemente ha sido descubierto como un componente clave de FemoCo. Sin lugar a dudas, se prepararán nuevos racimos FeMOS que contengan homocitrato, y tal vez estos activen las proteínas mutantes, revelando así una identidad cercana o completa con FemoCo.

A pesar de la ausencia de homocitrato, se han investigado algunos sistemas modelo interesantes. Está más allá del alcance de este capítulo dar una descripción integral de la química de FeMOS. Nos concentramos en los llamados sistemas modelo “tiocubane”. Los modelos Heterothiocubane se sintetizaron primero usando enfoques de autoensamblaje análogos a los utilizados para los sistemas de modelos Fe-S más simples. La reacción ^328-330a

\[MoS_{4}^{2-} + Fe^{3-} + SR^{-} \rightarrow (MoFe_{3}S_{4})_{2}(SR)_{9}^{3-} \; and\; (MoFe_{3}S_{4})_{2}Fe(SR)_{12}^{3-,4-} \tag{7.17}\]

utiliza tetratiomolibdato, MoS ₄ ^2-, como fuente de Mo, y conduce a las estructuras de doble cubino mostradas en la Figura 7.32A, B. La estructura Fe ₇ Mo ₂ S ₈ resultó particularmente interesante, ya que fue posible complejar el átomo de hierro férrico central con sustituyó a los ligandos de catecolato ^331,332 y finalmente aislaron una sola unidad de tiocubano (Figura 7.32C). Significativamente, la unidad individual tiene distancias S =\(\frac{3}{2}\) y Mo-S y Mo-Fe que coinciden precisamente con las encontradas por EXAFS para el centro M de nitrogenasa. También se han preparado cubos individuales con núcleos VMo ₃ S ₄. ^160,160a Aunque los tiocubanes individuales muestran similitud espectroscópica e identidad de distancia con FemoCo, no son modelos completos. Son estequiométricamente deficientes en Fe y S, carecen de homocitrato y, lo más importante, no logran activar los mutantes UW-45 y Nif B ^-.

En la Figura 7.33 se muestran otros conglomerados de FEMO (y FEW) interesantes con propiedades estructuralmente distintas. Estos incluyen el ion “lineal” (_{MoS 4}) ₂ Fe ^3-, el lineal (WS ₄) ₂ Fe [HCON (CH ₃) ₂] ₂ ^- ion, el lineal Cl ₂ FeS ₂ MS ₂ Fe ₂ CI ₂ ^2- (M = Mo, W), el “lineal” (MoS ₄) ₂ Fe ₂ S ₂ ^4- ion, el trigonal (WS ₄) ₃ Fe ₃ S ₂ ^4-, el tioprismano tapado Fe ₆ S ₆ X ₆ [M (CO) ₃] ₂ ^3- (X = CI, Br, I; M = Mo, W), y los racimos organometálicos MoFe ₆ S ₆ (CO) ₁₆ ^2-, MoFe ₃ S ₆ (CO) ₆ (PEt ₃₎ 3 y MoFe ₃ S ₆ (CO) ₆ ^2-. Las estructuras sugeridas para FemoCO basadas en estos y otros sulfuros de metales de transición sintetizados químicamente y en estudios espectroscópicos de la enzima se muestran en la Figura 7.31.