7.12: Rubredoxina- Una Proteína Tetratiolato de Fe Única

El papel fisiológico de las rubredoxinas (algunas veces abreviadas como Rd) no siempre se conoce con certeza. En particular, aunque la rubredoxina se identificó por primera vez ²⁶ en el anaerobio Clostridium pasteurianum, su papel en el metabolismo anaeróbico sigue siendo oscuro. Algunas rubredoxinas, como la del aerobio Pseudomonas oleovorans, participan en la\(\omega\) hidroxilación de ácidos grasos, es decir, hidroxilación al final de la cadena hidrocarbonada más alejada del ácido carboxílico. ²⁷ Al igual que las proteínas Fe _{2 S 2} putidaredoxina ²⁸ y adrenodoxina, ²⁹ la rubredoxina proporciona electrones a la hidroxilasa, que actúa como monooxigenasa formando el producto w-alcohol y agua (ver Figura 7.3). En una reacción catalizada por rubredoxina reductasa, la rubredoxina es reducida por NADH al estado ferroso y reoxidada por la w-hidroxilasa a la forma férrica durante el ciclo catalítico.

Figura 7.3 - Diagrama que ilustra los cambios redox que ocurren en la\(\omega\) -hidroxilasa dependiente de rubredoxina de Pseudomonas oleovorans. ²⁷

La mayoría de las rubredoxinas contienen un solo átomo de Fe, el cual puede existir en estado ferroso o férrico. Para la rubredoxina de Clostridium pasteurianum, ²⁶ el valor de E°' es de -57 mV, que es mucho más positivo que el de las ferredoxinas del mismo organismo (ver abajo). La proteína clostridial de 6 kDa tiene solo 54 aminoácidos en su cadena polipeptídica, y tiene un punto isoeléctrico muy bajo de 2.93. La rubredoxina de P. oleovorans ²⁷ tiene uno o dos átomos de hierro en una sola cadena polipeptídica de PM ~ 20 kDa. Su potencial redox es de -37 mV para la pareja Fe ^3+/2+. Las rubredoxinas como clase muestran una identidad de secuencia considerable, y los miembros 2Fe más grandes de la clase muestran evidencia, involucrando homología de secuencia interna, de que pueden haber evolucionado a través de la duplicación génica.

Una proteína de Desulfovibrio gigas, llamada desulforedoxina, ^30,31 parece parecerse a las rubredoxinas en algunos aspectos, pero los dos átomos de Fe en la proteína de 7.6 kDa parecen ser espectroscópica y estructuralmente distintos de los átomos de Fe en las rubredoxinas. ^Una proteína de Desulfovibrio vulgaris llamada ruberythrin tiene un sitio único de rubredoxina así como un sitio 2Fe fuertemente acoplado que se asemeja al de la hemeritrina. Se desconoce su función fisiológica. En el Cuadro 7.1 se enumeran algunas de las rubredoxinas conocidas y sus propiedades.

Cuadro 7.1 - Propiedades de algunas proteínas hierro-azufre.

a) tensores g' para ±\(\frac{1}{2}\) and ±\(\frac{3}{2}\) Kramers doublets, respectively, of the S = \(\frac{5}{2}\) system. The values of 0.9 and 1.25 are calculated (not observed)⁴⁴

b) La proteína totalmente reducida tiene un espectro complejo debido al acoplamiento magnético entre los dos clústeres idénticos de Fe _{4 S 4}. Los valores g son aquellos para muestras parcialmente reducidas, y representan un cúmulo aislado magnéticamente.

c) El espectro reportado es complejo debido a la interacción magnética con el grupo reducido de Fe ₃ S ₄.

d) La evidencia reciente sugiere que Thermus thermophilus y Thermus aquaticus son en realidad las mismas especies. ³⁶² parámetros EPR de la ferredoxina homóloga Thermus thermophilus estimados a partir de simulaciones por computadora. ³⁶¹ En esta proteína una señal originada del grupo Fe ₃ S ₄ a g'\(\simeq\) 12, attributable to \(\Delta\)M_s = ± 4 transitions, is observed for the reduced (S = 2) cluster.

Fuente de Proteína	Peso molecular (subunidades)	Composición Fe-S	Potención redox mV (pH)		EPR valores de g		Referencias
Rubredoxinas
Clostridium pasteurianum	6,000	Fe	-58 (7)	9.3	4.3		26
Pseudomonas oleovorans	6,000	Fe		9.42 4.02	0.9 4.77	1.25 ^a 4.31	44
Fe 2 S 2 Proteínas
Ferredoxina de espinacas	11,000	[2Fe-2S]	-420 (7.0)	2.05	1.96	1.89	350, 351
Ferredoxina de perejil	11,000	[2Fe-2S]		2.05	1.96	1.90	352
Euglena ferredoxina	11,000	[2Fe-2S]		2.06	1.96	1.89	352
Ferredoxina de la corteza suprarrenal (cerdo) [Adrenodoxina]	16,000	[2Fe-2S]	-270 (7.0)	2.02	1.93	1.93	352, 353
Ferredoxina de Pseudomonas putida [Putidaredoxina]	12,500	[2Fe-2S]	-240 (7.0)	2.02	1.93	1.93	352, 353
Clostridium pasteurianum	25,000	[2Fe-2S]	-300 (7.5)	2.00	1.96	1.94	354
Xantina Oxidasa	280,000 (2)	2 x [2Fe-2S] I 2 x [2Fe-2S] II	-343 (8.2) -303 (8.2)	2.02 2.12	1.94 2.01	1.90 1.91	355, 356
Thermus thermophilus Rieske	20,000	2 x [2Fe-2S]	+150 (7.8)	2.02	1.90	1.80	93, 357
Fe 4 S 4 Proteínas
Clostridium pasteurianum	6,000	2 x [4Fe-4S]	-420 (8.2)	2.06	1.92	1.89 ^b	115
Bacillus stearothermophilus	9,100	[4Fe-4S]	-280 (8.0)	2.06	1.92	1.89	358
Desulfovibrio concierto como ferredoxina I	18,000 (3)	[4Fe-4S]	-455 (8.0)	2.07	1.94	1.92	359
Aconitasa (corazón de res) [activo]	81,000	[4Fe-4S]		2.06	1.93	1.86
Chromatium vinosum HiPIP	10,000	[4Fe-4S]	+356 (7.0)	2.12	2.04	2.04	353
Paracoccus sp.	10,000	[4Fe-4S]	+282 (7.0)				353
Azotobacter vinlandii	14,500	[3Fe-4S] [4Fe-4S]	-645 (8.3)	2.06	1.93	1.89 ^c	360
Thermus aquaticus	10,500	[3Fe-4S] [4Fe-4S]	-550 (9.0)	2.06	1.93	1.92 ^c	353, 361
Fe 3 S 4 Proteínas
Desulfovibrio giga s Fd II	6,000 (4)	[3Fe-4S]	-130 (8.0)	2.02			359
Azotobacter vinlandii	14,500	[3Fe-4S] [4Fe-4S]	-450 (8.3)	2.01			360
Thermus aquaticus	10,500	[3Fe-4S] [4Fe-4S]	-260 (9.0)	2.02	1.99	1.94 ^d	353, 361
Aconitasa (corazón de res) [inactivo]	81,000	[3Fe-4S]		2.01

Se han determinado las estructuras cristalinas de rayos X de las rubredoxinas de C. pasteurianum ³² y D. vulgaris ³³. ^33a La estructura proteica de C. pasteurianum es conocida con una resolución de 1.2 Å, colocándola entre las metaloproteínas cuyas estructuras son conocidas con mayor precisión. Los átomos individuales de Fe y S son claramente resolubles. Como se muestra en la Figura 7.4, el hierro único está coordinado por cuatro ligandos S proporcionados por Cys-6, Cys-9, Cys-39 y Cys-42. La secuencia Cys-x-y-Cys es común en las proteínas Fe-S, ya que permite que ambos residuos de cisteína se unan al mismo sitio o agrupación metálica. Las distancias y ángulos Fe-S en la rubredoxina clostridial se muestran en el Cuadro 7.2. El rango de distancias y ángulos revela una estructura tetraédrica ligeramente distorsionada.

Figura 7.4 - La estructura cristalina de rayos X de la rubredoxina de Clostridium pasteurianum. ³²

Cuadro 7.2 - Distancias de unión y ángulos de unión alrededor del Fe en rubredoxina de Clostridium pasteurianum (W1). ³²

	Distancia (Å)
Fe-S [Cys (6)]	2.33 (11)
Fe-S [Cys (9)]	2.288 (15)
Fe-S [Cys (39)]	2.300 (15)
Fe-S [Cys (42)]	2.235 (12)
	Ángulo (°)
S-Fe-S [Cys (6) -Fe-Cys (9)]	113.8 (4)
S-Fe-S [Cys (6) -Fe-Cys (39)]	109.0 (4)
S-Fe-S [Cys (6) -Fe-Cys (42)]	103.8 (4)
S-Fe-S [Cys (9) -Fe-Cys (39)]	103.7 (4)
S-Fe-S [Cys (9) -Fe-Cys (42)]	114.3 (5)
S-Fe-S [Cys (39) -Fe-Cys (42)]	112.4 (5)

Los resultados estructurales iniciales sobre rubredoxina de C. pasteurianum se reportaron a una resolución ligeramente menor que los mostrados en el Cuadro 7.2. De hecho, el estudio temprano ³⁴ reportó un rango de distancias Fe-S de 2.05 a 2.34 Å. Previo al refinamiento de mayor resolución, se reportó un estudio de espectroscopía de absorción de rayos X con radiación sincrotrónica del borde de absorción de hierro de la rubredoxina. ^35,36 Utilizando la técnica de Estructura Fina de Absorción Extendida de Rayos X, * EXAFS, se encontró que la distancia promedio de Fe-S de ^35,36 era de 2.26 Å, de acuerdo con la distancia promedio desde el estudio cristalográfico de rayos X. Sin embargo, el EXAFS indicó un rango permisible mucho más estrecho de distancias Fe-S que el estudio cristalográfico temprano. El último tratamiento cristalográfico más refinado ³² coincidió muy bien con el resultado EXAFS, ilustrando la importancia de aplicar más de una técnica para la elucidación de parámetros clave. Aquí, al igual que con las proteínas 3Fe que discutiremos más adelante, el EXAFS demostró ser una técnica complementaria útil a la cristalografía de rayos X.

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* La espectroscopia de absorción de rayos X se usa más comúnmente (y convenientemente) con los bordes K de iones de metales de transición, como Fe o Mo. Se puede dividir en dos tipos distintos: Estructura de borde cercano de absorción de rayos X (o XANES) y espectroscopía de estructura fina de absorción de rayos X extendida (o EXAFS). El primero consiste en características cercanas al propio borde de absorción, que se deben a las transiciones del fotoelectrón a estados unidos y también a otros fenómenos más complejos (por ejemplo, las llamadas resonancias de forma). Aunque los espectros son altamente dependientes de la naturaleza del sitio, son bastante difíciles de interpretar, y la mayoría de los análisis se basan en comparaciones simples con espectros de compuestos modelo. Los EXAFS son oscilaciones del coeficiente de absorción a energías de rayos X bastante superiores, y surgen de la dispersión del fotoelectrón emitido por los átomos circundantes. A diferencia de los XANES, los espectros EXAFS son relativamente simples de interpretar de manera cuantitativa, produciendo una estructura radial local. Con una interpretación adecuada de los espectros, se pueden obtener distancias interatómicas muy precisas (por ejemplo, a ± 0.02 Å), más números de coordinación de ligandos y números atómicos más aproximados.

Los sitios de hierro tetraédricos en rubredoxinas ofrecen una interesante visión de la teoría del campo de ligando en acción, e ilustran el uso de diversos métodos físicos para deducir la estructura electrónica y la geometría de coordinación. Se espera que los cuatro ligandos de azufre dividan los orbitales 3d de hierro en conjuntos e y t ₂, con el conjunto e inferior como se muestra en la Figura 7.5. La pequeña división tetraédrica provoca que el ion 3d ⁵ Fe ³⁺ tenga cinco electrones desapareados, (e) ² (t ²) ³, ⁶ A ₁. Consistente con esta configuración, la susceptibilidad magnética de la rubredoxina da 5.85 magnetones Bohr.\(\mu_{eff}\) ³⁷ No se esperan transiciones de campo ligando-campo permitidas por giro, y el color rojo es causado por transiciones de transferencia de carga S → Fe en la región visible. ^38,39

Figura 7.5 - División de los orbitales 3d de Fe por el campo ligando tetraédrico de cuatro restos de cisteína coordinados: (A) Fe ³⁺; (B) Fe ²⁺.

En contraste, el estado 3d ⁶ Fe ²⁺, con un electrón adicional, tiene cuatro electrones desapareados, como lo confirma su momento magnético de 5.05 magnetones Bohr. En simetría tetraédrica exacta, se espera una absorción d-d única, de baja energía y baja intensidad de la designación ^{5 E → 5} T [(e) ³ (t ₂) ³ → (e) ² (t ₂) ⁴] para el sitio ferroso de alto espín (Figura 7.5). De hecho, la rubredoxina reducida muestra una banda en la región del infrarrojo cercano a 6,250 cm ^-1 que surge como componente de la transición ⁵ E → ⁵ T ₂. ⁴⁰ Esta banda destaca particularmente vívidamente en el espectro de dicroísmo circular (CD) de baja energía de la rubredoxina reducida. ⁴¹ Además, el dicroísmo circular magnético (MCD) ha demostrado ser valioso en la disección de transiciones electrónicas en varias rubredoxinas y proteínas de sulfuro metálico. ^38,39,42,43

El espectro EPR de rubredoxina oxidada (Figura 7.6) muestra picos característicos a g = 4.31 y 9.42 (P. oleovorans), que han sido asignados ⁴⁴ a transiciones dentro de dobletes Kramers excitados y en estado fundamental, respectivamente, de un\(\frac{5}{2}\) sitio S = casi completamente rómbico, con D = 1.8 y E = 0.5 cm ^-1. Estos valores para el ion Fe ³⁺ mononuclear se encuentran en agudo contraste con los de otras proteínas hierro-azufre, que suelen ser S =\(\frac{1}{2}\) (cuando se reducen) y tienen valores g cercanos a 2. El estado Fe ²⁺ de electrones pares (S = 2) en la rubredoxina reducida no tiene EPR detectable cuando se utilizan instrumentos convencionales. *

Figura 7.6 - Espectros EPR de diversas proteínas Fe-S: (A) rubredoxina oxidada de Desulfovibrio gigas; (B) ferredoxina reducida de espinacas [Fe ₂ S ₂] ⁺; (C) ferredoxina reducida de Bacillus stearothermophilus [Fe ₄ S ₄] ⁺; (D) Thermus aquaticus oxidado ferredoxina [Fe ₃ S ₄] ⁺; (E) oxidado Chromatium vinosum HiPIP [Fe ₄ S ₄] ⁺. (Espectros cortesía de S. J. George.)

La espectroscopia Mössbauer ha demostrado ser una herramienta complementaria particularmente poderosa a la EPR para sondear los sitios de hierro en proteínas Fe-S. ^3,37,51,52 Es una espectroscopia nuclear que puede dar información valiosa no disponible de otras técnicas. ^\(\dagger\)A diferencia de EPR, donde solo se “ven” los centros paramagnéticos, cada ⁵⁷ átomos de Fe en la muestra contribuirá al espectro de Mössbauer. Para la rubredoxina, la naturaleza de espín alto de los sitios férricos y ferrosos se ve claramente en los espectros de Mössbauer. ⁵³ Los sitios Fe ³⁺ de alto espín muestran una pequeña división cuadrupolar de aproximadamente 0.7-0.8 mm/s debido a la distribución casi esférica de los cinco electrones d en los orbitales de cinco d (Figura 7,7A). En contraste, el ion Fe ²⁺ de alto espín con un electrón d adicional tiene una asimetría significativa, y por lo tanto muestra una división cuadrupolo grande y bastante característica de 3.1-3.4 mm/s (Figura 7.7B). El cambio de isótopos también distingue entre Fe ²⁺ y Fe ³⁺, aunque no tan dramáticamente. ³⁷ Finalmente, la observación ⁵³ de interacción magnética hiperfina en el espectro de Mössbauer a baja temperatura en el estado Fe ³⁺ revela directamente la presencia de electrones desapareados, es decir, acoplamiento magnético con un campo hiperfino de 370 ± 3 kG. Aunque en rubredoxinas con un solo átomo de Fe, esta observación del acoplamiento magnético no revela ninguna nueva información, el acoplamiento magnético similar es particularmente útil para desentrañar los sitios Fe en proteínas multiférricas más complejas.

Figura 7.7 - Espectros de Mössbauer de diversos sitios Fe-S: (A) oxidado y (B) Fe reducido (SR) ₄ (Fe ³⁺ y Fe ²⁺, respectivamente) modelos de rubredoxina (datos de la Referencia 347); (C) oxidado y (D) reducido Scenedesmus Fe ₂ S ₂ ferredoxina (2Fe ³⁺ y [Fe ³⁺, Fe ²⁺], respectivamente, datos de la Referencia 348); (E) oxidado y (F) reducido Desulfovibrio gigas Fe ₃ S ₄ ferredoxina II (3Fe ³⁺ y [2Fe ³⁺, Fe ²⁺], respectivamente, datos de la Referencia 158); (G) oxidado y (H ) redujo la ferredoxina de Bacillus sterothermophilus Fe _{4 S 4} (datos de la Referencia 349).

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* Pero ver Referencia 45. La espectroscopia EPR utiliza campos magnéticos para dividir los estados de espín electrónico en niveles que difieren según la energía en la región de microondas del espectro. Para un\(\frac{1}{2}\) sistema S =, el valor g (y su anisotropía) y los valores a (división hiperfina de varios núcleos y su anisotropía) son los principales parámetros reportados. La espectroscopia EPR ha jugado un papel en el desarrollo de la bioquímica Fe-S similar al papel desempeñado por la espectroscopia óptica en el desarrollo de la bioquímica de los citocromos, ^46-49 particularmente para mitocondrias ⁴⁷ y cloroplastos, ⁵⁰ donde la señal g = 1.9 EPR tiene facilitó el monitoreo del flujo de electrones a través de estos sistemas redox. Aunque la EPR ha sido una herramienta poderosa, sí tiene algunas limitaciones importantes. Una condición necesaria pero no suficiente para la EPR es que el centro a observar debe estar en estado paramagnético. Afortunadamente, esta condición se cumple para al menos un miembro de cada par redox de un electrón, es decir, la especie de electrón impar. Sin embargo, incluso cuando la especie de electrones pares es paramagnética, generalmente no se observa en la EPR, debido a la presencia de grandes divisiones de campo cero. Además, los efectos de relajación y/o la población de estados excitados a menudo hacen que la EPR de proteínas sea inobservable a temperatura ambiente, requiriendo el uso de N ₂ líquido o temperaturas He líquidas para observar las señales en estado congelado. La necesidad de congelar muestras antes de la observación puede conducir a artefactos que involucran la observación de estados y procesos no fisiológicos. En el lado positivo, la baja temperatura aumenta la intensidad de la señal al alterar la distribución de Boltzmann de la población de espín, y permite utilizar diversas técnicas de enfriamiento con EPR para evaluar parámetros cinéticos y electroquímicos. Sin embargo, no se suele observar la cinética en tiempo real o estar seguro de que se está observando un estado fisiológicamente relevante. A pesar de estas advertencias, EPR ha demostrado ser una herramienta valiosa y, en algunos casos, indispensable para la identificación y monitoreo de sitios Fe-S. Recientemente, las técnicas avanzadas de EPR ENDOR (Electron Nuclear Double Resonance) y ESEEM (Electron Spin Echo Envelope Modulation) han permitido la extracción de información adicional de la señal EPR.

^\(\dagger\)La espectroscopia Mossbauer mide la absorción nuclear de la luz\(\gamma\) a energías de rayos, y puede usarse para sondear niveles de energía nuclear (generalmente de ⁵⁷ Fe). La división de estos niveles está influenciada por la densidad de electrones en el núcleo, y por el gradiente de campo eléctrico que es establecido por los átomos cercanos. Estos factores afectan el desplazamiento de isómeros y la división cuadripolar del espectro de Mössbauer, respectivamente. También se dispone de información sobre acoplamientos hiperfinos nucleares cuando se realizan experimentos en presencia de un campo magnético externo (generalmente aplicado). Afortunadamente, el núcleo más comúnmente (y fácilmente) estudiado por esta técnica está presente en todas las proteínas discutidas en este capítulo, aunque el nivel de ⁵⁷ Fe (2 por ciento de abundancia natural) debe ser incrementado por enriquecimiento isotópico para lograr una relación señal-ruido lo suficientemente alta. Para los espectros que contienen un tipo de sitio, los espectros son relativamente sencillos de interpretar. Para sistemas multisitio se requiere deconvolución para obtener datos en centros individuales. Cuando es posible, el etiquetado selectivo de sitios con ⁵⁷ Fe es extremadamente útil en el proceso de deconvolución.

Se han reportado estudios de RMN tanto en el estado oxidado como en el estado reducido de las rubredoxinas. Los átomos de hierro fuertemente paramagnéticos tienen un profundo efecto en los espectros de RMN de protones en las proximidades del hierro. El hierro afecta drásticamente el comportamiento de relajación de tales protones, provocando la ampliación de la línea, a veces tanto que los protones se vuelven no observables. Si se observan, los protones se desplazan lejos de los valores encontrados en las proteínas diamagnéticas por combinaciones de acoplamiento de contacto Fermi (a través de superposición/enlace pasante) y pseudo-contacto (a través del espacio/dipolar). ^54,55 En las rubredoxinas, el estado reducido muestra espectros resueltos, ^37,56 los cuales pueden asignarse ⁵⁶ con la ayuda de datos de sistemas modelo. *

La espectroscopia Raman de resonancia proporciona información que involucra vibraciones moleculares que no depende de las propiedades nucleares ni magnéticas. La excitación electrónica de bandas que implican transferencia de carga S → Fe a menudo conduce a la mejora de resonancia de los modos de estiramiento Fe-S. En rubredoxina, ^57,57a las vibraciones de estiramiento Fe-S se ubican entre 300-400 cm ^-1. Las desviaciones del patrón tetraédrico esperado de dos bandas (modos T ₂ y _A1) son atribuibles al acoplamiento de las vibraciones Fe-S con los modos de flexión S-C-C. Este acoplamiento genera una mayor variabilidad, y la asignación vibratoria detallada es, por lo tanto, más difícil para las bandas que involucran los átomos de azufre de cisteinilo. En contraste, para sitios que contienen S ^2- inorgánico, las vibraciones Fe-S que involucran el núcleo inorgánico son menos variables y por lo tanto más características del tipo de núcleo. ⁵⁷

En teoría, cada una de las técnicas espectroscópicas aplicadas a las rubredoxinas puede dar información útil sobre las otras proteínas hierro-azufre. En la práctica, algunas técnicas han demostrado ser más útiles que otras en situaciones particulares, y el uso combinado de varias técnicas es necesario para sacar conclusiones significativas.

Los estudios químicos de las rubredoxinas han llevado a la sustitución del Fe ²⁺ con un centro Fe _{4 S 4}, ⁵⁸ con Co ²⁺ y con Ni ²⁺. El reemplazo de Co ²⁺ de Fe ²⁺, en rubredoxina de P. oleovorans, conduce a una proteína estable que muestra reactividad reducida (pero no trivial) en la reacción de\(\omega\) -hidroxilación. ^59,60 Las propiedades espectrales del sitio cobalto (II) muestran los cambios esperados en las bandas d-d y los cambios esperados en las transiciones de transferencia de carga. ⁵⁹ Curiosamente, cuando Ni ²⁺ es sustituido en rubredoxinas de especies desulfovibrio, las proteínas resultantes muestran actividad hidrogenasa. ⁶¹

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* La RMN es una técnica cuya gran utilidad en el estudio de proteínas de bajo peso molecular y sistemas modelo no se ha trasladado (todavía) al estudio de proteínas de mayor tamaño. Tasas de volteo más lentas, relajación electrónica rápida, múltiples sitios paramagnéticos, gran cantidad de protones y soluciones más diluidas conspiran para hacer de la observación y/o interpretación de espectros de RMN una tarea desalentadora en proteínas redox multisitio de > 50 kDa.