13.4: Instrumentación

Componentes Básicos

Como se contempla en el Capítulo 7, la instrumentación básica para las mediciones de absorbancia consiste en una fuente de radiación, un medio para seleccionar las longitudes de onda a utilizar, un medio para detectar la cantidad de luz absorbida por la muestra, y un medio para procesar y mostrar los datos. En esta sección consideramos otros dos componentes esenciales de un instrumento para medir la absorbancia de la radiación UV/Vis por moléculas: la ruta óptica que conecta la fuente con el detector y un medio para colocar la muestra en esta trayectoria óptica.

Diseños de Instrumentos para Absorción Molecular UV/Vis

Con frecuencia, un analista debe seleccionar entre varias rutas ópticas diferentes, la que mejor se adapte a un análisis particular. En esta sección se examinan diversos instrumentos para la espectroscopia de absorción molecular con énfasis en sus ventajas y limitaciones.

Fotómetro de filtro

El instrumento más simple para la absorción molecular UV/Vis es un fotómetro de filtro (Figura\(\PageIndex{1}\)), que utiliza un filtro de absorción o interferencia para aislar una banda de radiación. El filtro se coloca entre la fuente y la muestra para evitar que la muestra se descomponga cuando se expone a radiación de mayor energía. Un fotómetro de filtro tiene una única trayectoria óptica entre la fuente y el detector, y se llama instrumento de haz único. El instrumento se calibra a 0% T mientras se usa un obturador para bloquear la radiación de la fuente del detector. Después de abrir el obturador, el instrumento se calibra al 100% T usando una pieza en blanco apropiada. Luego se reemplaza el blanco con la muestra y se mide su transmitancia. Debido a que la potencia incidente de la fuente y la sensibilidad del detector varían con la longitud de onda, el fotómetro se recalibra cada vez que se cambia el filtro. Los fotómetros tienen la ventaja de ser relativamente económicos, resistentes y fáciles de mantener. Otra ventaja de un fotómetro es su portabilidad, lo que hace que sea fácil de llevar al campo. Las desventajas de un fotómetro incluyen la incapacidad de registrar un espectro de absorción y el ancho de banda efectivo relativamente grande de la fuente, lo que limita la linealidad de la curva de calibración.

El porcentaje de transmitancia varía entre 0% y 100%. Utilizamos un blanco para determinar P ₀, que corresponde al 100% T. Incluso en ausencia de luz el detector registra una señal. Cerrar el obturador nos permite asignar 0% T a esta señal. Juntos, ajustando 0% T y 100% T calibra el instrumento. La cantidad de luz que pasa a través de una muestra produce una señal que es mayor o igual a 0% T y menor o igual a 100% T.

Figura\(\PageIndex{1}\). Diagrama esquemático de un fotómetro de filtro. El analista o bien inserta un filtro removible o los filtros se colocan en un carrusel, ejemplo del cual se muestra en el recuadro fotográfico. El analista selecciona un filtro girándolo en su lugar.

Espectrofotómetro de haz único

Un instrumento que utiliza un monocromador para la selección de longitud de onda se llama espectrofotómetro. El espectrofotómetro más simple es un instrumento de haz único equipado con un monocromador de longitud de onda fija (Figura\(\PageIndex{2}\)). Los espectrofotómetros de haz único se calibran y se utilizan de la misma manera que un fotómetro. Un ejemplo de un espectrofotómetro de un solo haz es Spectronic 20D+ de Thermo Scientific, que se muestra en el inserto fotográfico de la Figura\(\PageIndex{2}\). El Spectronic 20D+ tiene un rango de longitud de onda de 340—625 nm (950 nm cuando se usa un detector sensible al rojo) y un ancho de banda efectivo fijo de 20 nm. Hay disponibles espectrofotómetros de un solo haz de mano que funcionan con baterías, que son fáciles de transportar al campo. Otros espectrofotómetros de haz único también están disponibles con anchos de banda efectivos de 2—8 nm. Los espectrofotómetros de haz único de longitud de onda fija no son prácticos para registrar espectros porque ajustar manualmente la longitud de onda y recalibrar el espectrofotómetro es incómodo y requiere mucho tiempo. La precisión de un espectrofotómetro de un solo haz está limitada por la estabilidad de su fuente y detector a lo largo del tiempo.

Figura\(\PageIndex{2}\). Diagrama esquemático de un espectrofotómetro de haz único de longitud de onda fija. El inserto fotográfico muestra un instrumento típico. El obturador permanece cerrado hasta que la muestra o la pieza en blanco se coloca en el compartimiento de la muestra. El analista selecciona manualmente la longitud de onda ajustando el dial de longitud de onda. Foto incrustada modificada de: Adi (www.Commons.wikipedia.org).

Espectrofotómetro de doble haz

Las limitaciones de un espectrofotómetro de haz único de longitud de onda fija se minimizan mediante el uso de un espectrofotómetro de doble haz (Figura\(\PageIndex{3}\)). Un helicóptero controla la trayectoria de la radiación, alternándola entre la muestra, el blanco y un obturador. El procesador de señales utiliza la velocidad de rotación del helicóptero para resolver la señal que llega al detector en la transmisión de la pieza en blanco, P ₀, y la muestra, P _T. Al incluir una superficie opaca como obturador, también es posible ajustar continuamente 0% T. El ancho de banda efectivo de un espectrofotómetro de doble haz se controla ajustando las ranuras de entrada y salida del monocromador. Los anchos de banda efectivos de 0.2—3.0 nm son comunes. Un monocromador de barrido permite el registro automatizado de espectros. Los instrumentos de doble haz son más versátiles que los instrumentos de haz simple, siendo útiles tanto para análisis cuantitativos como cualitativos, pero también son más caros y no particularmente portátiles.

Figura\(\PageIndex{3}\). Diagrama esquemático de un espectrofotómetro de doble haz de barrido. Un helicóptero dirige la radiación de la fuente, usando una ventana transparente para pasar la radiación a la muestra y un espejo para reflejar la radiación al blanco. La superficie opaca del picador sirve como obturador, lo que permite un ajuste constante del 0% T del espectrofotómetro. El inserto fotográfico muestra un instrumento típico. El módulo en el centro de la foto es una unidad de control de temperatura que permite calentar o enfriar la muestra a una temperatura constante.

Espectrómetro de matriz de diodos

Un instrumento con un solo detector puede monitorear solo una longitud de onda a la vez. Si reemplazamos un solo fotomultiplador con una matriz de fotodiodos, podemos usar el detector resultante para registrar un espectro completo en tan solo 0.1 s. En un espectrómetro de matriz de diodos la radiación de origen pasa a través de la muestra y es dispersada por una rejilla (Figura\(\PageIndex{4}\)). El detector de matriz de fotodiodos está situado en el plano focal de la rejilla, registrando cada diodo la potencia radiante en un rango estrecho de longitudes de onda. Debido a que reemplazamos un monocromador completo con solo una rejilla, un espectrómetro de matriz de diodos es pequeño y compacto.

Figura\(\PageIndex{4}\). Diagrama esquemático de un espectrofotómetro de matriz de diodos. El inserto fotográfico muestra un instrumento típico. Tenga en cuenta que el vaso de precipitados de 50 ml proporciona un sentido de escala. Debido a que el espectrómetro es pequeño y compacto, es fácil de transportar al campo.

Una ventaja de un espectrómetro de matriz de diodos es la velocidad de adquisición de datos, lo que nos permite recolectar múltiples espectros para una sola muestra. Se agregan espectros individuales y se promedian para obtener el espectro final. Este promedio de señal mejora la relación señal/ruido de un espectro. Si sumamos n espectros, la suma de la señal en cualquier punto, x, aumenta como nS _x, donde S _x es la señal. El ruido en cualquier punto, N _x, es un evento aleatorio, que aumenta como\(\sqrt{n} N_x\) cuando sumamos n espectros. La relación señal/ruido después de n escaneos, (S/N) _n es

\[\left(\frac{S}{N}\right)_{n}=\frac{n S_{x}}{\sqrt{n} N_{x}}=\sqrt{n} \frac{S_{x}}{N_{x}} \nonumber \]

donde S _x/N _x es la relación señal/ruido para un solo escaneo. El impacto del promedio de la señal se muestra en la Figura\(\PageIndex{5}\). El primer espectro muestra la señal después de una exploración, que consiste en un único pico ruidoso. El promedio de señal usando 4 escaneos y 16 escaneos disminuye el ruido y mejora la relación señal/ruido. Una desventaja de una matriz de fotodiodos es que el ancho de banda efectivo por diodo es aproximadamente un orden de magnitud mayor que el de un monocromador de alta calidad.

Figura\(\PageIndex{5}\). Efecto del promedio de la señal sobre la relación señal/ruido de un espectro. De arriba a abajo: espectro para un solo escaneo; espectro promedio después de cuatro escaneos; y espectro promedio después de agregar 16 escaneos.

Células de muestra

El compartimento de muestras proporciona un ambiente hermético a la luz que limita la radiación parásita. Las muestras normalmente están en estado líquido o en solución, y se colocan en celdas construidas con materiales transparentes UV/Vis, como cuarzo, vidrio y plástico (Figura\(\PageIndex{6}\)). Se requiere una celda de cuarzo o sílice fundida cuando se trabaja a una longitud de onda <300 nm donde otros materiales muestran una absorción significativa. La longitud de trayectoria más común es de 1 cm (10 mm), aunque hay disponibles celdas con longitudes de trayectoria más cortas (tan solo 0.1 cm) y más largas (hasta 10 cm). Las celdas de mayor longitud de trayectoria son útiles cuando se analiza una solución muy diluida o para muestras de gas. Las celdas de la más alta calidad permiten que la radiación golpee una superficie plana en un ángulo de 90 ^o, minimizando la pérdida de radiación a la reflexión. Un tubo de ensayo a menudo se usa como celda de muestra con instrumentos simples de un solo haz, aunque las diferencias en la longitud de trayectoria de la celda y las propiedades ópticas agregan una fuente adicional de error al análisis.

FFigura\(\PageIndex{6}\). Ejemplos de células de muestra para espectroscopía UV/Vis. De izquierda a derecha (con longitudes de trayectoria entre paréntesis): cubeta rectangular de plástico (10.0 mm), cubeta rectangular de cuarzo (5.000 mm), cubeta rectangular de cuarzo (1.000 mm), cubeta cilíndrica de cuarzo (10.00 mm), cubeta cilíndrica de vidrio con ventanas de cuarzo (100.0 mm). Las celdas a menudo están disponibles como un par emparejado, lo cual es importante cuando se usa un instrumento de doble haz.

Si necesitamos monitorear la concentración de un analito a lo largo del tiempo, es posible que no sea posible extraer muestras para su análisis. Este suele ser el caso, por ejemplo, cuando se monitorea una línea de producción industrial o línea de desechos, cuando se monitorea la sangre de un paciente, o cuando se monitorea un sistema ambiental, como una corriente. Con una sonda de fibra óptica podemos analizar muestras in situ. Un ejemplo de una sonda de fibra óptica de detección remota se muestra en fFigure\(\PageIndex{7}\). La sonda consta de dos haces de cable de fibra óptica. Un haz transmite radiación desde la fuente a la punta de la sonda, que está diseñada para permitir que la muestra fluya a través de la celda de muestra. La radiación de la fuente pasa a través de la solución y es reflejada de nuevo por un espejo. El segundo haz de cable de fibra óptica transmite la radiación no absorbida al selector de longitud de onda. Otro diseño reemplaza la celda de flujo mostrada en la Figura\(\PageIndex{7}\) con una membrana que contiene un reactivo que reacciona con el analito. Cuando el analito se difunde en la membrana reacciona con el reactivo, produciendo un producto que absorbe radiación UV o visible. La radiación no absorbida de la fuente se refleja o dispersa de nuevo al detector. Las sondas de fibra óptica que muestran selectividad química se denominan optrodos [(a) Seitz, W. R. Anal. Chem. 1984, 56, 16A—34A; b) Angel, S. M. Espectroscopia 1987, 2 (2), 38—48].

Figura\(\PageIndex{7}\). Ejemplo de una sonda de fibra óptica. Las fotografías insertadas en la parte inferior de la figura proporcionan vistas en primer plano de la celda de flujo de la sonda y el espejo reflectante.