2.12: Proteína Suérica Total

LECIONES RELACIONADAS: Capítulo 27. Ver Métodos en CD-ROM para Proteína Suérica Total

OBJETIVO

Al finalizar este ejercicio, discusión apropiada y lectura relacionada, el alumno podrá:

1. Mida la proteína total sérica con 90% de precisión utilizando los métodos de biuret e índice de refracción.
2. Comparar los valores obtenidos de la medición colorimétrica y del índice de refracción de proteína.
3. Identificar cualquier diferencia significativa en los valores determinados por cada método.
4. Enumere la (s) sustancia (s) que interferirá con cada método.

PRINCIPIO

Biuret — Los iones cúpricos en una solución alcalina se unirán a los enlaces peptídicos de las moléculas proteicas y formarán un color azul-violeta. Este complejo puede medirse fotométricamente y usarse para determinar las concentraciones de proteínas.

Índice de Refracción - El suero u otros fluidos que contengan sólidos disueltos refractarán la luz incidente. La cantidad de refracción es proporcional a la cantidad de sólidos disueltos. Si se hacen correcciones para sustancias no proteicas, este método proporciona una estimación confiable de la concentración de proteínas.

glosario

Medidor TS - otro nombre para un refractómetro. TS significa Sólidos totales, que es lo que mide el refractómetro.

Salino normal -concentración de NaC1 (solución salina) que se aproxima a las concentraciones fisiológicas, generalmente 0.15 M, 0.85%, o 0.9%.

Reactivo blanco: una solución que consiste en reactivo y solución salina (en lugar de muestra) en las proporciones empleadas en las reacciones utilizadas para “poner a cero” un espectrofotómetro (100% T).

MATERIALES

• Estándar
• Reactivo Biuret
• Tubos de ensayo
• Controles
• Agua Destilada
• Pipetas
• Muestras de pacientes
• Espectrofotómetros
• 3% DE NAOH
• Medidor TS (Sólidos Totales) Salino Normal

PROCEDIMIENTO

Método Biuret

1. Marque suficientes tubos de ensayo de 13 x 100 mm para un blanco de reactivo, controles y las muestras de suero a analizar.
2. Usando una pipeta serológica de 5 mL, pipetee 4.9 mL de NaOH al 3% en cada tubo.
3. Pipetear 100\(\mu\) L de agua destilada en el blanco de reactivo.
4. Pipetee 100\(\mu\) L de control, estándar o suero en cada tubo de ensayo debidamente etiquetado.
5. Pipetear 1.0 mL de reactivo biuret en todos los tubos.
6. Mezclar con un mezclador vortex o por inversión.
7. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
8. Ajustar el espectrofotómetro a 520 nm y ajustar la absorbancia cero usando el reactivo en blanco. Transferir las mezclas de reacción a una cubetaapropiada y medir la absorbancia de cada tubo a 520 nm.
9. Registre sus resultados en la hoja de datos y calcule los valores totales de proteína para cada muestra utilizando el método de cálculo proporcional.
10. Registrar cualquier característica inusual de las muestras.

Método del refractómetro

1. Limpie el refractómetro cuidadosamente con agua destilada y seque.
2. Colocar una gota de muestra (estándar, control o suero) en la “etapa” del refractómetro.
3. Utilizando suficiente luz, indagar en el instrumento y determinar el valor total de proteína a partir de la escala apropiada y registrarlo en la hoja de datos.
4. Limpie el “área del escenario” a fondo con agua destilada y seque.
5. Repita los pasos 2 a 4 para cada muestra adicional a medir.

ACTIVIDAD OPCIONAL

Mida el índice de refracción del agua destilada, 0.85% NaCl y cualquier otro material que su instructor haya preparado para usted. Registre sus resultados en la hoja de datos.

FICHA TÉCNICA, EJERCICIO #12

NOMBRE: ___________ FECHA: ___________

RESULTADOS

Proteína Total, g/L	Absorbancia a 520 nm	Biuret	Medidor TS	Comentarios de la muestra
Estándar
Control Normal
Control anormal
Muestra #
Muestra #
Muestra #
Muestra #
Agua destilada
0.85% NaCl
Otros

Preguntas de Discusión

1. ¿Hubo alguna diferencia significativa en los valores determinados por los dos métodos? Si hubo diferencias significativas, explique las posibles causas.
2. ¿Cree que el índice de refracción podría ser utilizado como método regular para las determinaciones de proteínas séricas? En caso afirmativo, qué limitiaciones tiene. Si no, ¿por qué no?
3. ¿Cuáles son las principales interferencias en el método biuret? ¿Método de refractometría?