2.21: Ailasa (método de alquitrán modificado)

LECTURA RELACIONADA: Capítulo 29 Consulte Métodos en CD-ROM para amilasa.

OBJETIVO

Al finalizar este ejercicio, discusión apropiada y lectura relacionada, el alumno podrá:

1. Describir la acción fisiológica de la amilasa.
2. Enumerar cuatro tipos de metodologías de amilasa.
3. Realizar una determinación de amilasa sérica.
4. Identificar el color único del complejo yodudo-almidón.

PRINCIPIO

El método yodométrico (amiloclástico) se basa en la capacidad del yoduro para formar un color azul vivo en combinación con almidón. El almidón es hidrolizado por amilasa en la muestra para liberar moléculas más pequeñas como dextrano, maltosa y algunas moléculas de glucosa. Las moléculas de azúcar más pequeñas no forman un complejo con yoduro y no dan un color azul. A medida que se descompone más almidón, disminuye la intensidad del color azul. El sustrato (almidón) y la muestra (amilasa) se mezclan y se incuban por un tiempo fijo. Se agrega solución de color yoduro y se forma el complejo de color almidón/yoduro. Se realiza una medición espectrofotométrica para determinar la intensidad de color (absorbancia). Cuanto menor sea la absorbancia final (cuanto mayor sea la diferencia entre las soluciones en blanco y las soluciones de prueba), mayor será la actividad de amilasa sérica.

MATERIALES

• Tubos de ensayo 13 x 100 mm
• Bloque calefactor o baño de agua
• Tubos de ensayo de 16 x 100 mm
• Espectrofotómetro
• Tubos de ensayo de 19 x 150 mm
• Control normal
• Sustrato de almidón
• Muestras de suero
• Reactivo de yoduro
• Pipetas
• Agua Destilada
• Solución salina al 0.9%

PROCEDIMIENTO

1. Colocar aproximadamente 4 mL de sustrato de almidón en un tubo de ensayo etiquetado de 16 x 100 mm. Colocar el tubo en un bloque térmico a 37°C o baño de agua durante un mínimo de 5 minutos para precalentarlo. Continuar calentando a 37°C hasta que sea necesario para el paso 7.
2. Etiquete dos tubos de ensayo de 19 x 150 mm para cada control y muestra a ensayar. Etiquete uno de cada par de tubos “blank” y el otro “test”.
3. Pipetee 21.0 mL de agua destilada en cada uno de los tubos de ensayo de 19 x 150 mm (“blank” y “test”). Coloque estos tubos a un lado para su uso futuro.
4. Etiquete dos tubos de ensayo de 13 x 100 mm para cada control y muestra a ensayar.
5. Pipetea 1.0 mL de solución salina 0.9% en cada tubo de 13 x 100 mm.
6. Pipetea 30\(\mu\) L del testigo o muestra apropiada en cada tubo de 13 x 100 mm etiquetado como “test”. Mezclar cada uno por inversión e incubar todos los tubos de 13 x 100 mm (“ensayo” y “blanco”) a 37°C durante 5 minutos para prewam.
7. Después del precalentamiento de 5 minutos, mientras se continúa incubando, agregar 0.5 mL de sustrato de almidón
   calentado (de la etapa 1) a todos los tubos de 13 x 100 mm (“blanco” y “prueba”). Incubar cada tubo durante exactamente 7 minutos.

Nota

Puede que le resulte conveniente agregar el sustrato de almidón a los tubos a intervalos de 30 segundos. Esto permitirá una sincronización más exacta.

8. Después de exactamente 7 minutos de incubación, agregue 2.0 mL de solución de yoduro a cada tubo.
9. Agregar 30\(\mu\) L de control o muestra apropiada a cada tubo “blanco”.
10. Transfiera el contenido de cada tubo de 13 x 100 mm al tubo de ensayo de 19 x 150
    mm correspondiente del paso 3. Mezclar por inversión.
11. Mida la absorbancia de la mezcla en cada tubo (“prueba” y “blanco”) a 660
    nm contra un blanco de agua destilada. Registrar la absorbancia en la hoja de datos.
12. Calcular el valor de amilasa para cada material probado utilizando la fórmula que se muestra
    a continuación: $$\ frac {A_ {blank} - A_ {test}} {A_ {blank}}\ times 5000 =\ text {Unidades de amilasa/L} $$Registre los valores en la hoja de datos.

FICHA TÉCNICA, EJERCICIO #21

NOMBRE: ___________ FECHA: ___________

RESULTADOS

	Absorbancia 660 nm		Unidades de amilasa/L
	Blank	Test
Control normal
Muestra #
Muestra #

PREGUNTA DE DISCUSIÓN

1. ¿El blanco utilizado en este experimento es un reactivo o muestra en blanco?
2. ¿Por qué es necesario usar un “blank” para cada muestra?
3. ¿Por qué es necesario conocer el método utilizado para determinar un valor de amilasa para discutir un rango de referencia?