2.22: Electroforesis de isoenzima de creatina quinasa (CK)

LECTURA RELACIONADA: Capítulo 55 Ver Métodos en CD-ROM para isoenzimas de creatina quinasa.

OBJETIVO

Al finalizar este ejercicio, discusión apropiada y lecturas relacionadas, el alumno podrá:

1. Realizar una electroforesis y desarrollar el electroforetograma con una tinción enzimática.
2. Identificar cada isoenzima CK en el electrofortograma.
3. Interpretar el patrón de isoenzimas CK, relacionándolo con un posible estado de enfermedad.

MÉTODO

Electroforesis Corning con desarrollo colorimétrico de P-L Biochemicals u otro reactivo apropiado.

PRINCIPIO

Las isoenzimas CK se separan electroforéticamente en placas de agarosa a 90 V, pH 8.6. Luego se puede aplicar un sustrato que puede convertirse en un producto fluorescente por CK y observar las bandas de isoenzimas bajo luz UV.

GLOSARIO

Aplicación - término utilizado para describir el proceso de colocar un pequeño volumen de solución sobre una fase estacionaria (placa de capa fina, gel, papel o columna) para la separación cromatográfica o electroforética.

MATERIALES

• Buffer barbital (pH 8.6)
• Gel de agarosa
• Sustrato CK (Corning #0
• Incubadora a 39°C
• Cámara de electroforesis
• Horno de secado
• Aplicador de muestras
• Fuente de luz UV
• Muestras de suero
• Control CK

PROCEDIMIENTO

1. Llene cada cámara de base celular de electroforesis con 95 mL de tampón barbital, pH 8.6 (bueno para un solo uso).
2. Retire el respaldo de plástico de la película de agarosa.
3. Aplicar alícuotas de 1.0\(\mu\) L de cada suero a un pozo de muestra, permitiendo que la muestra se absorba entre aplicaciones. Coloque un control en la posición 3 o 4 (use 2 aplicaciones para el control).
4. Cargue la película de agarosa en el casete superior para que el lado negativo corresponda al lado negativo del casete inferior.
5. Electroforesis a 90 V por 20 minutos.
6. Cerca del final de la electroforesis, reconstituir un vial de reactivo Fluorométrico Cardiotrac CK con 1.0 mL de solución tampón. Remolino para disolver.
7. Preparar la bandeja de la incubadora con la almohadilla secante humedecida y preincubar la bandeja a 39°C.
8. Inmediatamente después de la electroforesis, retire la película del casete. Coloca la película sobre una superficie plana con el lado positivo (+) cerca de ti y borra los bordes. Vierta todo el contenido del vial de sustrato a lo largo de un borde. Con una pipeta serológica de 5 mL, extienda suavemente el líquido del lado positivo al negativo colocando la pipeta sobre su lado en la solución y usándola como “esparcidor”.
9. Colocar el gel de película hacia arriba sobre una bandeja precalentada de la incubadora, secar y reemplazar la cubierta, e incubar durante 20-30 minutos a 39°C (el aumento de la incubación mejora la sensibilidad).
10. Retirar la película de agarosa de la bandeja de incubación y secar a 55°C. Secar en horno por 15-20 minutos o hasta que se seque.
11. Inspeccione con luz UV o escanee en un densitómetro fluorescente.
12. Adjuntar una copia del trazado densitométrico o parte del gel de agarosa al fondo de la hoja de datos.

FICHA TÉCNICA, EJERCICIO #22

NOMBRE: ___________ FECHA: ___________

RESULTADOS

Observe las bandas de la siguiente manera: (cátodo a ánodo)

• CK (BB) - migra estrechamente con la albúmina.
• CK (MB) - migra entre CK-BB y CK-MM
• CK (MM) - permanece cerca del origen.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA

1. Total normal de CK normal con pequeñas cantidades de actividad enzimática en la fracción CK (MM). No hay MB o BB detectables.
2. CK anormal (MB) presente. Indicativo de daño cardíaco o necrosis. Generalmente acompañado de MM elevado y CK total elevado.
3. Aumento anormal de CK (MM). Refleja lesión al músculo esquelético debido a inyección intramuscular (IM), cirugía, etc. ocurre en la distrofia muscular; puede ir acompañada de MB elevada.
4. CK anormal (BB) presente. Refleja la liberación de tejido cerebral debido a un accidente cerebrovascular, necrosis u otro trauma cerebral o daño al intestino grueso o a los tejidos pulmonares.

Adjuntar copia de exploración densitométrica o parte de gel de agarosa a continuación.

Preguntas de Discusión

1. ¿Qué bandas eran visibles en tu muestra? ¿Qué sugiere esto?
2. Comparar los hallazgos de este ejercicio con la actividad enzimática total de CK en la misma muestra del ejercicio CK. ¿Los resultados se apoyan entre sí?
3. ¿Cómo podría ser posible convertir la mancha fluorescente en una mancha de color visible en la iluminación normal de la habitación?