11.8: Gel Secante
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La transferencia en gel es una técnica para visualizar un subconjunto particular de macromoléculas —proteínas, o fragmentos de ADN o ARN— inicialmente presentes en una mezcla compleja. Los pasos:
- Separar las moléculas por electroforesis. Esto se hace en un gel que permite que las moléculas migren bajo la influencia del campo eléctrico.
- “Secarlos” con un filtro de nitrocelulosa. Por razones desconocidas, las moléculas se adhieren firmemente al filtro y conservarán sus posiciones relativas cuando se inunden con líquido en el siguiente paso.
- Baña el filtro con una solución que contenga una “sonda”: una molécula que se combinará específicamente con las moléculas diana; es decir, la (s) que estás buscando y lleva una media de visualización, por ejemplo, un marcador radiactivo o fluorescente.
Southern Blot
El diagrama ilustra el procedimiento para detectar fragmentos de ADN que contienen una secuencia particular. El ADN se extrae de la célula y se digiere parcialmente por una endonucleasa de restricción. Los fragmentos de ADN resultantes se separan por electroforesis y luego se desnaturalizan para formar moléculas monocatenarias (ADNss). Sin alterar sus posiciones, las bandas separadas de ADNss se transfieren a un filtro de nitrocelulosa y se exponen a ADNc o ARN radiomarcado. Si la sonda detecta secuencias de ADN complementarias, se unirá a ellas. La presencia de la sonda en una banda particular se revela mediante autorradiografía.
Este procedimiento fue desarrollado por E. M. Southern y el producto terminado se denomina “Southern blot”. El mismo procedimiento básico también se puede utilizar para separar y visualizar moléculas de ARN y moléculas de proteína. Como extensión humorística del término “Southern blot”, estas han sido denominadas “Northern” y “Western” blots, respectivamente (Tabla\(\PageIndex{1}\)).
| Tipo de Blot | Moléculas separadas por electroforesis | Sonda |
|---|---|---|
| Sur | ssDNA | ADNc o ARN |
| Norte | ARN desnaturalizado | ARN o ADNc |
| Western | Proteína | Anticuerpos |