20.1: Aislamiento de ADN, Electroforesis en Gel y PCR

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La biotecnología es el uso de métodos artificiales para modificar el material genético de organismos vivos o células para producir nuevos compuestos o para realizar nuevas funciones. La biotecnología se ha utilizado para mejorar la ganadería y los cultivos desde el inicio de la agricultura a través de la cría selectiva. Desde el descubrimiento de la estructura del ADN en 1953, y particularmente desde el desarrollo de herramientas y métodos para manipular el ADN en la década de 1970, la biotecnología se ha convertido en sinónimo de la manipulación del ADN de los organismos a nivel molecular. Las principales aplicaciones de esta tecnología son en la medicina (para la producción de vacunas y antibióticos) y en la agricultura (para la modificación genética de cultivos). La biotecnología también tiene muchas aplicaciones industriales, como la fermentación, el tratamiento de derrames de petróleo y la producción de biocombustibles, así como muchas aplicaciones domésticas como el uso de enzimas en detergentes para ropa.

Gráfico circular que muestra porcentajes de empresas biotecnológicas por aplicación. — **Figura\(\PageIndex{1}\): La** mayoría de las empresas biotecnológicas se dedican a la salud humana. Crédito de la foto 1Rileyw; Wikimedia.

Para lograr cualquiera de las aplicaciones descritas anteriormente, los biotecnólogos deben ser capaces de extraer, manipular y analizar ácidos nucleicos.

Revisión de la Estructura del Ácido Nucleico

Para comprender las técnicas básicas utilizadas para trabajar con ácidos nucleicos, recuerde que los ácidos nucleicos son macromoléculas hechas de nucleótidos (un azúcar, un fosfato y una base nitrogenada). Los grupos fosfato en estas moléculas tienen cada uno una carga neta negativa. Un conjunto completo de moléculas de ADN en el núcleo de organismos eucariotas se llama genoma. El ADN tiene dos cadenas complementarias unidas por enlaces de hidrógeno entre las bases emparejadas.

A diferencia del ADN en las células eucariotas, las moléculas de ARN abandonan el núcleo. El ARN mensajero (ARNm) se analiza con mayor frecuencia porque representa los genes codificadores de proteínas que se están expresando en la célula.

Aislamiento de ácidos nucleicos

Para estudiar o manipular los ácidos nucleicos, primero se debe extraer el ADN de las células. Se utilizan diversas técnicas para extraer diferentes tipos de ADN (Figura\(\PageIndex{2}\)). La mayoría de las técnicas de extracción de ácidos nucleicos implican pasos para romper la célula y luego el uso de reacciones enzimáticas para destruir todas las macromoléculas no deseadas. Las células se abren por rotura usando una solución detergente que contiene compuestos amortiguadores. Para evitar la degradación y contaminación, macromoléculas como las proteínas y el ARN se inactivan usando enzimas. Luego, el ADN se saca de la solución usando alcohol. El ADN resultante, al estar formado por polímeros largos, forma una masa gelatinosa. Este método extrae todo el ácido nucleico dentro de una célula. Esto incluye el ADN genómico (todo el ADN en el genoma), así como el ARN. Si este ADN fuera a ser utilizado para estudios posteriores, el ARN a menudo sería digerido con una enzima para eliminarlo.

Se ilustran cuatro tubos de ensayo, mostrando cuatro pasos en la extracción de ADN. En la primera, las células se lisan usando un detergente que rompe la membrana plasmática. En el segundo, los contenidos celulares se tratan con proteasa para destruir la proteína, y RNasa para destruir el ARN. En el tercero, los desechos celulares se sedimentan en una centrífuga. El sobrenadante (líquido) que contiene el ADN se transfiere a un tubo limpio. En el cuarto tubo de ensayo, el ADN se precipita con etanol. Forma hebras viscosas que se pueden enrollar en una varilla de vidrio. — **Figura\(\PageIndex{2}\):** Este diagrama muestra el método básico utilizado para la extracción de ADN.

El ARN se estudia para comprender los patrones de expresión génica en las células. El ARN es naturalmente muy inestable porque las enzimas que descomponen el ARN están comúnmente presentes en la naturaleza. Algunos incluso son secretados por nuestra propia piel y son muy difíciles de inactivar. Similar a la extracción de ADN, la extracción de ARN implica el uso de diversos tampones y enzimas para inactivar otras macromoléculas y preservar solo el ARN.

Electroforesis en Gel

Debido a que los ácidos nucleicos son iones cargados negativamente a pH neutro o alcalino en un ambiente acuoso, pueden ser movidos por un campo eléctrico. La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar moléculas cargadas en función del tamaño y la carga. Los ácidos nucleicos se pueden separar como cromosomas completos o como fragmentos. Los ácidos nucleicos se cargan en una ranura en un extremo de una matriz de gel, se aplica una corriente eléctrica y las moléculas cargadas negativamente se tiran hacia el extremo opuesto del gel (el extremo con el electrodo positivo). Las moléculas más pequeñas se mueven a través de los poros en el gel más rápido que las moléculas más grandes; esta diferencia en la velocidad de migración separa los fragmentos en función del tamaño. Los ácidos nucleicos en una matriz de gel son invisibles hasta que se tiñen con un compuesto que les permita ser vistos, como un colorante. Distintos fragmentos de ácidos nucleicos aparecen como bandas a distancias específicas de la parte superior del gel (el extremo negativo del electrodo) que se basan en su tamaño (Figura\(\PageIndex{3}\)). Una mezcla de muchos fragmentos de diferentes tamaños aparece como un frotis largo, mientras que el ADN genómico sin cortar suele ser demasiado grande para atravesar el gel y forma una sola banda grande en la parte superior del gel.

La foto muestra un fondo negro con 9 bandas verticales de color gris tenue (carriles). En esas bandas se encuentran bandas horizontales blancas ligeramente borrosas de diferentes espesores y brillo. Los tenues carriles grises en los bordes izquierdo y derecho tienen muchas bandas horizontales, y los 7 en el medio tienen solo unas pocas cada una, en diferentes posiciones. — **Figura\(\PageIndex{3}\):** Se muestran fragmentos de ADN de seis muestras ejecutadas en un gel, teñidas con un tinte fluorescente y vistas bajo luz UV. (crédito: modificación de obra de James Jacob, Tompkins Cortland Community College)

Reacción en cadena de polimerasa

El análisis de ADN a menudo requiere enfocarse en una o más regiones específicas del genoma. También frecuentemente involucra situaciones en las que solo una o unas pocas copias de una molécula de ADN están disponibles para su posterior análisis. Estas cantidades son insuficientes para la mayoría de los procedimientos, como la electroforesis en gel. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica utilizada para aumentar rápidamente el número de copias de una región específica del ADN para análisis posteriores (Figura\(\PageIndex{4}\)). Normalmente el ADN que se utiliza como muestra de partida en una reacción de PCR es ADN genómico, que contendría todos los genes en el organismo. La PCR utiliza una forma especial de ADN polimerasa tolerante al calor, la enzima que replica el ADN, y otras secuencias cortas de nucleótidos llamadas cebadores que se emparejan con una porción específica del ADN que se está copiando. Una reacción de PCR no copia todo el genoma, sino que hace millones de copias de una región específica de interés.

ADN polimerasa Taq — esta polimerasa fue aislada de Thermus aquaticus, que es una bacteria que vive a altas temperaturas en aguas termales y respiraderos de aguas profundas. La Taq polimerasa tiene una temperatura óptima de 70-80ºC y puede sobrevivir casi una hora a 95ºC. Al igual que otras ADN polimerasas, la Taq polimerasa ensambla nucleótidos solo en la dirección 5′ a 3′.
Cebadores — Al igual que durante la replicación del ADN, la polimerasa Taq necesita un extremo 3' libre para comenzar la síntesis del nuevo ADN. Los cebadores en una reacción de PCR son segmentos sintéticos artificiales de ADN que coinciden con los extremos de la secuencia que el científico está interesado en amplificar. Para sintetizar ambas cadenas de la doble hélice de ADN, se debe agregar un cebador directo y uno inverso. Estos dos cebadores tienen extremos 3' libres que apuntan hacia la secuencia de interés (Figura\(\PageIndex{4}\), medio).

La PCR se utiliza para muchos propósitos en laboratorios. Estos incluyen: 1) la identificación del dueño de una muestra de ADN dejada en la escena del crimen; 2) el análisis de paternidad; 3) la comparación de pequeñas cantidades de ADN antiguo con organismos modernos; y 4) la determinación de la secuencia de nucleótidos en una región específica. En todos estos casos, la muestra inicial es ADN genómico. En algunos casos, el genoma completo puede no estar presente debido a que el ADN es viejo o descompuesto.

La PCR implica los siguientes pasos básicos:

Desnaturalización (94ºC): La muestra se calienta en un pequeño tubo de plástico dentro de un termociclador (que es capaz de cambiar rápidamente las temperaturas con mucha precisión). El calentamiento de la muestra a 94ºC hace que los enlaces de hidrógeno que sostienen la doble hélice de ADN se desnaturalicen de manera que las hebras se separen (Figura\(\PageIndex{4}\), arriba). La Taq polimerasa es tolerante al calor y no se desnaturaliza a esta temperatura.
Recocido (54-60ºC): La muestra se enfría para que los cebadores puedan aparearse (par de bases) con su secuencia complementaria (Figura\(\PageIndex{4}\); medio). Debido a las reglas de emparejamiento de bases, los cebadores solo pueden aparearse en el punto específico que contiene su secuencia de bases complementaria. Esto permite a los científicos elegir qué región de ADN se amplificará.
Extensión (72ºC): La muestra se calienta a la temperatura óptima para la polimerasa Taq. Taq se extiende fuera del extremo 3' libre de ambos cebadores, produciendo una doble hélice (Figura\(\PageIndex{4}\); parte inferior).

Diagrama de los tres pasos de la PCR: desnaturalización, reasociación y extensión. — **Figura\(\PageIndex{4}\):** Los pasos de una reacción de PCR. Crédito de la foto Tinojasontran; Wikimedia.

Las tres etapas básicas de una reacción de PCR se repiten múltiples veces (“ciclos”). Cada ciclo provoca un aumento de aproximadamente 2x en el número de copias amplificadas de la sección específica de interés (Figura\(\PageIndex{5}\)). Recuerde que solo se está amplificando una sección del ADN debido a la especificidad de los cebadores.

Diagrama de reacción PCR para demostrar cómo la amplificación conduce al crecimiento exponencial de un producto corto flanqueado por los cebadores. — **Figura\(\PageIndex{5}\):** El ciclo repetido provoca el crecimiento exponencial de la secuencia deseada. Crédito de la foto Madprime; Wikimedia.

Consulta\(\PageIndex{1}\)

Consulta\(\PageIndex{2}\)

Consulta\(\PageIndex{3}\)

Para la siguiente pregunta, arrastre DOS cebadores a la ubicación apropiada donde se aparearían. La punta de flecha muestra el extremo 3′ del cebador. Ten en cuenta que la ADN polimerasa Taq solo puede extenderse desde el 3′ del cebador.

Consulta\(\PageIndex{4}\)

Referencias

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OpenStax, Biología. OpenStax CNX. mayo 27, 2016 http://cnx.org/contents/s8Hh0oOc@9.10:8CA_YwJq@3/Cloning-and-Genetic-Engineering