3.4: Vectores de expresión procariotas

El primer vector que consideraremos es la familia de vectores pUC

Figura 3.4.1: vector pUC

Aunque no se usa típicamente para la expresión de proteínas recombinantes, tiene todos los elementos necesarios de un vector de expresión:

1. Un origen de replicación. La familia de vectores pUC son vectores de copia alta. Tienen un origen de replicación ColE1, pero una deleción de la región reguladora de replicación rop.
2. Un marcador de resistencia a fármacos. Los vectores pUC contienen un gen para resistencia a ampicilina (b-lactamasa).
3. Un promotor inducible. Esta familia de vectores contiene el promotor lac (_Plac) junto con la región Operadora lac asociada (O _lac)

Estos vectores contienen un par de otros elementos que agregan utilidad al vector:

1. El gen lacI. Este gen codifica para la proteína represora lac. Al ser un plásmido de alto número de copias, los niveles del represor lac del hospedador pueden no ser suficientes para reprimir de manera eficiente el operador lac en los plásmidos. El plásmido produce represor lac para aumentar los niveles del hospedador.
2. El gen lacZ'. Este producto génico se transcribe a partir del promotor lac y produce un fragmento amino-terminal de la proteína b -galactosidasa.
3. Un polienlazador (sitio de clonación múltiple). Este corto tramo de ADN se localiza justo aguas abajo del promotor lac y después de los primeros codones del gen lacZ'. Es un tramo corto de nucleótidos que contiene una variedad de sitios de endonucleasas de restricción.

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a -complementación

El promotor lac del plásmido pUC se puede inducir usando el análogo de lactosa isopropiltiol-b-D-galactósido. (“IPTG”).

• Esto dará como resultado la expresión del gen lacZ'.
• Este gen codifica un fragmento amino-terminal de la proteína b -galactosidasa
• Por sí mismo, este fragmento no es funcional (no hidrolizará lactosa u otros b -galactósidos)

Sin embargo, la b- galactosidasa es una proteína interesante:

• Si expresamos el fragmento carboxi terminal de la proteína, también es no funcional
• Pero, si combinamos ambos fragmentos peptídicos pueden combinarse para producir una proteína b -galactosidasa funcional
• Esto se denomina a -complementación

La mutación LacZ D M15 en una bacteria significa que su genoma ha sufrido una deleción de la región amino-terminal del gen lacZ.

• Dicha bacteria tiene una proteína b -galactosidasa no funcional
• Si este tipo de bacterias contiene un elemento extracromosómico que expresa el péptido LacZ', puede complementar la proteína LacZ D M15 para producir proteína b -galactosidasa funcional (a -complementación)

El galactósido, 5-bromo-4-cloro-3-indoil-b -D-galactósido (“X-gal”), puede ser hidrolizado por b -galactosidasa y produce un color azul oscuro.

• Las bacterias LacZ D M15 en presencia de lactosa (o IPTG) y X-gal aparecerán de un color blanco-amarillo normal.
• Las mismas bacterias que albergan el plásmido pUC anterior serán de color azul oscuro cuando IPTG y X-gal estén presentes en el medio (debido a la complementación a y una proteína b -galactosidasa funcional)

La región polienlazadora pUC

La región polienlazadora pUC es un tramo corto de ADN que en realidad se inserta dentro del gen lacZ', justo aguas abajo del codón de inicio:

Figura 3.4.2: Región de polienlazador pUC

Nota

En el diagrama anterior los números de codones para la b -galactosidasa de tipo silvestre se dan en magenta (en este caso la metionina iniciadora no está presente en la proteína purificada y el primer codón se considera el residuo ACC (treonina)). Los codones del polyliner (que interrumpen el gen b -galactosidasa) se dan en negro.

• Las diferentes regiones plink disponibles son todas un múltiplo de 3 nucleótidos de longitud, por lo tanto, el gen lacZ' permanece en marco.
• El péptido LacZ' /plink resultante todavía puede funcionar en la complementación a.

¿Qué pasaría con el péptido LacZ' si insertamos un fragmento de ADN en la región plink?

• La inserción de una pieza aleatoria de ADN en la región plink dará como resultado tres posibles marcos de lectura diferentes después del inserto (dependiendo del número de nucleótidos en el fragmento insertado)
• Existe una posibilidad del 33% (uno de cada tres) de que el gen lacZ' aguas abajo se traduzca en el marco de lectura correcto
• También existe la posibilidad de que aunque el marco de lectura sea correcto, la inserción de un péptido grande al inicio de la proteína LacZ' evitará una complementación.
• Por lo tanto, la mayor parte del tiempo, un fragmento de ADN insertado en la región plink abolirá la función b -galactosidasa
• Por lo tanto, los insertos de ADN en la región plink pueden identificarse cultivando la bacteria huésped en medios que contienen IPTG y X-gal y buscando colonias blanco-amarillas (con la advertencia de que algunas colonias azules de hecho pueden contener un inserto)

El ADN que codifica un gen de interés puede insertarse en la región plink en marco con el marco de lectura lacZ.

• La proteína codificada por este gen se puede expresar por inducción con IPTG (es decir, usando el _Plac)
• La proteína expresada tendrá como secuencia amino-terminal los primeros aminoácidos del gen b -galactosidasa (en ausencia de cualquier otra manipulaciones/mutagénesis). Esto también se conoce como una proteína de fusión (corta).
• Aunque el promotor lac se considera relativamente débil, el plásmido de alto número de copias puede dar como resultado un nivel útil de expresión de la proteína de interés

El sistema de vectores pET (Novagen, Inc.)

El vector pET se ve así:

Figura 3.4.3: Vector pET

Cuenta con los siguientes elementos importantes:

• Marcador de resistencia a ampicilina
• Origen de replicación ColE1
• f1 origen de replicación (permite que se produzca un vector monocatenario cuando se coinfecta con fago auxiliar M13)
• Gen lacI (proteína represora lac)
• Promotor de transcripción T7 (específico para ARN polimerasa de fago T7)
• región del operador lac 3' al promotor T7
• sitio de clonación múltiple (región polienlazadora) aguas abajo del promotor T7

El vector pET es un poco diferente del vector pUC: pUC usa el promotor lac y pET usa un promotor del fago T7

• El promotor del fago T7 es más fuerte que el promotor lac
• La ARN polimerasa del fago T7 reconocerá específicamente la región promotora de T7 y no se transcribirá de manera eficiente a partir de otros promotores
• El promotor T7 no será transcrito eficientemente por la ARN polimerasa de E. coli

¿De dónde vendrá la ARN polimerasa del fago T7?

El sistema pET implica no solo un vector de expresión, sino también una bacteria hospedadora genéticamente modificada. La bacteria hospedadora para el vector pET es típicamente la cepa BL (DE3) de E. coli

• Esta cepa ha integrado en su cromosoma el gen de la ARN polimerasa T7
• La ARN polimerasa T7 en el genoma del huésped se construye de tal manera que está bajo el control de un promotor y operador lac
• Así, la inducción por el análogo de lactosa, IPTG, hace que el huésped produzca ARN polimerasa T7
• El genoma huésped de E. coli también porta el gen lacI (represor)

Figura 3.4.4: Cromosoma E.coli BL (DE3)

Así, la inducción por IPTG da como resultado:

• Desrepresión del gen Pol de ARN T7 en el cromosoma del huésped con posterior producción de esta polimerasa
• Desrepresión del gen diana bajo regulación lac O
• Transcripción del gen diana por ARN Pol T7

Así, el sistema empareja a un promotor fuerte con una regulación apretada (es decir, un nivel de expresión extremadamente bajo en el estado reprimido)

El propio vector pET está disponible con varias secuencias polienlazadoras diferentes. Contienen los mismos sitios de restricción, pero difieren en el marco de lectura que conduce a la región pLink:

Figura 3.4.5: Secuencias de polienlazadores

• El sitio ggatcc (sitio de endonucleasa de restricción BamH I) es el primer sitio de restricción en el polienlazador.
• Por lo tanto, la región polienlazadora está disponible en los tres diferentes marcos de lectura posibles
• Por lo tanto, un gen de interés puede clonarse para que esté en marco con la región transcrita aguas abajo del promotor T7. Nuevamente, al igual que el vector pUC, la proteína expresada será una proteína de fusión (con 12-13 aminoácidos en el extremo amino-terminal del polipéptido)

El sistema de vectores pTRCHIS (Invitrogen, Inc.)

El vector pTRCHIS se ve así:

Figura 3.4.6: Vector pTRCHIS

Los elementos importantes son:

• Marcador de resistencia a ampicilina
• Origen de replicación ColE1
• Gen lacI ^q. Esta es una mutación del represor lac que está regulada positivamente (produce más represor lac de lo normal)
• Promotor trc. Este es un híbrido de los promotores lac y trp que es un promotor más fuerte en comparación con el promotor lac
• La región del operador lac aguas abajo de P _trc. Esto permite la regulación por parte del IPTG.
• Un tramo inicial de 6 residuos de histidina en la región amino terminal de la proteína traducida, también conocida como región “etiqueta His”.
• Una secuencia de reconocimiento de escisión de enterocinasa (EK) (asp asp asp asp lys, con escisión después del residuo de lys)
• Una región polienlazadora aguas abajo del sitio EK

Propósito de la etiqueta His

• Los residuos de histidina pueden coordinarse para formar un sitio de unión de metal (Ni ²⁺) en una proteína.
• El tramo de seis residuos de His forma dicho sitio de unión.
• Las proteínas con una etiqueta His tienen afinidad por las resinas quelantes de metales, y esta característica puede ser utilizada para purificar selectivamente tales proteínas.

Propósito del sitio de escisión de EK

• Aunque la etiqueta His puede permitir la purificación rápida y selectiva de una proteína clonada, la presencia de estos restos his puede impedir la función normal de la proteína
• La etiqueta His se puede escindir de la proteína introduciendo una secuencia de reconocimiento específica para una endopeptidasa.
• La secuencia “asp asp asp asp lys” es reconocida y escindida por la enterocinasa. Esta secuencia no es común y es dudoso que la proteína de interés contenga otra secuencia de este tipo

Figura 3.4.7: Escisión de enterocinasa

• Los sitios His etiquetas/EK se introducen típicamente en el extremo amino de las proteínas, pero también se pueden introducir en el extremo carboxilo terminal

Anfitriones de expresión

Una de las características importantes de los huéspedes de expresión (bacterias) es que permiten que la proteína expresada se acumule.

• Algunas proteínas expresadas pueden no estar plegadas correctamente. Aunque pueden replegarse más tarde para producir proteína funcional, las proteínas mal plegadas pueden ser proteolizadas rápidamente en la bacteria huésped
• Las proteasas huésped pueden escindir selectivamente formas precursoras de proteínas expresadas para producir formas activas maduras, lo que puede no ser deseable.
• Los genes ompT y lon codifican proteasas que pueden degradar las proteínas expresadas.
• ^{Dos mutaciones comunes en E. coli para eliminar la acción de las proteasas hospedadoras incluyen las cepas ompT y lon.}
• E. coli cepa BL (DE3) es tanto OmpT ^- y lon ^-