4.4: SELEX (Evolución Selectiva de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial)

Tuerk y Oro, Ciencia (1990) 249:505-510

El genoma del fago T4 codifica una ADN polimerasa (T4 DNA pol)

El ARNm para T4 DNA pol contiene una secuencia que tiene afinidad de unión por T4 DNA pol. Esta secuencia se solapa con la secuencia Shine/Dalgarno y la unión de T4 ADN pol impide que el ARNm se transcriba (y produzca más pol de ADN de T4). Así, la expresión de T4 DNA pol es autorreguladora (regulación autógena). La estructura del ARNm en esta región forma una estructura tallo-bucle

Figura 4.4.1: ARNm de la ADN polimerasa T4

El diseño experimental:

En términos simples, generar una biblioteca de moléculas de ARNm con una secuencia de nucleótidos aleatoria en la región bucle. Esta biblioteca tendrá un tamaño de 4 ⁸ o 65,536 secuencias singularmente diferentes (si solo se aleatoriza la región de bucle). Identificar aquellas secuencias con alta afinidad por T4 DNA pol y determinar su secuencia.

Construcción de plantillas

Un molde de ADN dúplex de “gen sintético” se construye a partir de cinco cebadores:

Figura 4.4.2: Construcción de plantillas

• El gen sintético tiene 110 nucleótidos de longitud. Se compone de los oligonucleótidos #3, #4 y #5. Los oligonucleótidos #1 y #2 pueden considerarse como oligos “puente” que permiten ligar #3, #4 y #5
• El oligonucleótido #4 contiene el extremo 5' del gen Pol de ADN T4 correspondiente a la secuencia Shine/Dalgarno de ARNm y la etapa/bucle de unión a pol de ADN T4. Se sintetiza para contener bases aleatorias en la estructura de bucle de 8 bases de largo del dominio de unión a pol de ADN T4.
• El oligonucleótido #1 contiene la secuencia para la región promotora de la ARN polimerasa T7. La transcripción se puede conducir a partir de este promotor mediante la adición de ARN polimerasa T7 y ribonucleótidos.

transcripción in vitro

• El gen de 110 nucleótidos (forma de ADN bicatenario) se puede transcribir in vitro por ARN pol T7
• La transcripción produce una molécula de ARN de 92 nucleótidos de longitud. Habrá una biblioteca de potencialmente 65.536 moléculas de ARN únicas

Figura 4.4.3: Transcripción in vitro

Selección por unión a pol de ADN de T4

Aquellos transcritos de ARN con una secuencia que confiere especificidad de unión para T4 DNA pol se seleccionan por incubación de la biblioteca de ARN con T4 DNA pol que ha sido inmovilizado en filtros de nitrocelulosa. Los filtros se lavan para eliminar las moléculas de ARN unidas no específicamente. Las moléculas de ARN de unión estrecha (específica) se eluyen de la proteína pol de ADN T4 y se recogen

Figura 4.4.4: Unión específica

Construcción de ADNc

Las moléculas de ARN eluidas se convierten en ADNc monocatenario usando el oligonucleótido #5 como cebador, y añadiendo transcriptasa inversa y dNTP. El ADN dúplex se produce a partir del ADNc monocatenario mediante PCR usando los oligonucleótidos #1 y #5.

Figura 4.4.5: Construcción de ADNc

Transcripción in vitro

• La transcripción in vitro produce una biblioteca (más pequeña) de moléculas de ARN enriquecidas para secuencias con afinidad de unión por ADN pol T4
• el proceso de selección y enriquecimiento continúa hasta que se ha producido una colección de secuencias de unión de alta afinidad

Resultados experimentales

1. Construcción de bibliotecas

• La biblioteca original de “genes sintéticos” se secuenció en masa
• Una “escalera” de bases en la posición aleatoria indicó que la biblioteca comenzó siendo más o menos una colección completamente aleatoria de secuencias en esta región (es decir, no parecía haber ningún sesgo de secuencia en la colección de moléculas)

2. Las muestras de las rondas secuenciales de selección y amplificación se guardaron para el análisis de secuenciación

• Los resultados indicaron que a medida que continuaba el proceso de selección y amplificación se observaron ciertas bases en posiciones específicas en la región mutagenizada de 8 bases

Figura 4.4.6: Secuencia mutante

La secuencia de tipo silvestre se pudo encontrar dentro de esta mezcla heterogénea de secuencias de unión estrecha. Se secuenciaron 20 clones de esta biblioteca final.

Figura 4.4.7: Mezcla de secuencias de unión estrecha

• Había esencialmente solo dos secuencias diferentes presentes: la secuencia de tipo silvestre conocida y otra secuencia diferente (que variaba en cuatro posiciones)
• Ambos tenían características similares de unión estrecha (las secuencias menores identificadas exhibieron una unión más débil)
• Esta secuencia alternativa puede tener una estructura tallo-bucle diferente que la de tipo silvestre

Figura 4.4.8: Cambio en la estructura del tallo-asa

Conclusiones

1. El método SELEX identificó exitosamente la secuencia de tipo silvestre y una secuencia alternativa (previamente desconocida) con propiedades de unión a pol de ADN T4 de alta afinidad
2. Los resultados sugieren que la secuencia del operador de traducción de tipo salvaje está prácticamente optimizada para la unión (¿no se puede mejorar aún más?)
3. El método SELEX debería simplificar el estudio de las interacciones entre
   • activadores y represores transcripcionales y complejos transcripcionales en sitios promotores
   • proteínas accesorias de replicación y polos de ADN en los orígenes de replicación
   • ribosomas y represores traduccionales en sitios de unión a ribosomas
4. Los resultados pueden ser relevantes para las interacciones de unión ADN/proteína en ciertos casos (es decir, si las interacciones no involucran el grupo 2' hidroxilo y si está involucrada una estructura que pueda adoptar el ADN)
5. En lugar de comenzar con todas las secuencias posibles, comience con una biblioteca más pequeña y combine la replicación con polimerasas propensas a errores para generar secuencias adicionales