6.5: Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)

Revisar

La replicación del ADN se logra mediante la enzima ADN polimerasa que tiene las siguientes características:

1. La ADN polimerasa cataliza la extensión de un oligonucleótido en la dirección 5'→3'. No puede ir en sentido contrario.
2. Se requiere un molde de ADN (es decir, oligonucleótido de cadena sencilla). Esta es la información que se replica (a través del emparejamiento de bases Watson-Crick). Si quieres replicar la hebra “sentido” de un dúplex de ADN, entonces la plantilla es la hebra anti-sentido. Dado que el ADN es un dúplex, mantenido unido por fuerzas no covalentes, podemos separar las cadenas del dúplex (y obtener un molde apropiado) por desnaturalización por calor (o álcali).
3. La ADN polimerasa solo puede extender un oligonucleótido existente, no puede iniciar la replicación. Así, además de un molde, la ADN polimerasa requiere de un oligonucleótido cebador. La ADN polimerasa extiende el cebador en la dirección 5' → 3'.
4. Los nucleótidos incorporados en el oligonucleótido naciente deben ser nucleósidos trifosfatos (es decir, dNTP). La energía liberada en la hidrólisis de los enlaces de anhídrido de fosfato se utiliza en la formación de enlaces covalentes (incorporación del a-fosfato en la cadena principal de fosfodiéster del oligonucleótido en crecimiento)
5. Aunque las ADN polimerasas catalizan la extensión en la dirección 5' → 3', algunas tienen la capacidad de "probar la lectura”. La “lectura de pruebas” es la capacidad de reconocer una incorporación errónea de una base, y la capacidad de respaldar e extirpar la base incorrecta, para luego continuar.

Figura 6.5.1: Síntesis de ADN

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

• La PCR es una técnica in vitro para la amplificación de una región de ADN que se encuentra entre dos regiones de secuencia conocida.
• La amplificación por PCR se logra mediante el uso de cebadores de oligonucleótidos. Estos son típicamente oligonucleótidos monocatenarios cortos que son complementarios a las regiones externas de secuencia conocida.

Figura 6.5.2: Amplificación por PCR

Los oligonucleótidos sirven como cebadores para la ADN polimerasa y cada una de las cadenas desnaturalizadas del dúplex de ADN parental sirve como molde.

Esto da como resultado la síntesis de nuevas cadenas de ADN que son complementarias a las cadenas molde parentales.

Los pasos de:

1. Desdesnaturalización de la plantilla
2. Recocido de cebadores
3. Extensión de imprimación

comprender un único “ciclo” en la metodología de amplificación por PCR.

• Después de cada ciclo, las cadenas de ADN recién sintetizadas pueden servir como moldes en el siguiente ciclo (los cebadores de PCR se añaden típicamente en exceso molar sustancial al ADN molde)

Resumen de productos al final de cada ciclo de PCR:

Figura 6.5.3: Productos de PCR

El producto de PCR deseado será un dúplex del fragmento de longitud definida. La pregunta es: ¿cuántos se producirán?

· La amplificación esperada del producto de longitud definida deseada con respecto a la concentración de molde original 'x' se puede representar por la fórmula:

[(2 ⁿ - (n + 1)) - (n + 1)] x

o

(2 ⁿ - 2 (n + 1))

(esto a menudo se abrevía a una simple regla general para la amplificación: (2 ⁿ - 2n) x)

· La interpretación de esta fórmula es que

• Para un número dado de ciclos 'n' hacemos '2 ⁿ x' dúplex totales posibles
• Para un número dado de ciclos habrá '2 (n+1) (o 2n en nuestra aproximación) x' dúplex que se forman a partir de la plantilla original, o un fragmento de longitud indeterminada, junto con un fragmento de longitud definida (y representan un producto no deseado)
• Así, la concentración total del producto deseado (dúplex con una longitud definida por los cebadores de PCR) será
  (2 ⁿ - 2 (n+1)) x (donde x es la concentración del dúplex original)

El valor teórico de amplificación nunca se alcanza en la práctica. Varios factores impiden que esto suceda, incluyendo:

1. La competencia de cadenas hijas complementarias con cebadores para la rehibridación (es decir, la rehibridación de dos cadenas hijas no produce amplificación).

2. Pérdida de actividad enzimática por desnaturalización térmica, especialmente en los ciclos posteriores

3. Incluso sin desnaturalización térmica, la cantidad de enzima se vuelve limitante debido al exceso de diana molar en ciclos posteriores (es decir, después de 25 a 30 ciclos, muchos cebadores necesitan extenderse)

4. Posible hibridación del cebador del segundo sitio y cebado no productivo

Parámetros de ciclo térmico

Los parámetros del ciclo térmico son críticos para un experimento de PCR exitoso. Los pasos importantes en cada ciclo de PCR incluyen:

1. desnaturalización de la plantilla (típicamente realizada a la temperatura más alta - 100°C)

2. hibridación de cebadores (la temperatura se elige en función de la temperatura de fusión del cebador)

3. extensión de los cebadores (realizada en el óptimo para la polimerasa que se está utilizando)

Un perfil de temperatura representativo para cada ciclo podría tener el siguiente aspecto:

Figura 6.5.4: Ciclos térmicos

Bufferes y MgCl ₂ en reacciones de PCR

Un tampón de reacción típico para PCR sería algo así como:

• Tris 10 mM, pH 8.3
• 50 mM KCl
• 1.5 mM MgCl ₂
• Gelatina al 0.01%
• La concentración de MgCl ₂ en la mezcla de reacción final suele estar entre 0.5 y 5.0 mM, y la concentración óptima se determina empíricamente (típicamente entre 1.0 - 1.5 mM). Iones ^{Mg 2+}:
  • formar un complejo soluble con dNTP que es esencial para la incorporación de dNTP
  • estimular la actividad de la polimerasa
  • aumentar la Tm (temperatura de fusión) de la interacción cebador/molde (es decir, sirve para estabilizar la interacción dúplex

En general,

• bajo Mg ²⁺ conduce a rendimientos bajos (o ningún rendimiento) y
• alto Mg ²⁺ conduce a la acumulación de productos inespecíficos (cebado erróneo).

Elección de polimerasas para PCR

• Uno de los avances importantes que permitieron el desarrollo de la PCR fue la disponibilidad de polimerasas termoestables.
• Esto permitió que la enzima inicialmente añadida sobreviviera a ciclos de temperatura cercanos a los 100 °C.

• Propiedades de las ADN polimerasas utilizadas en PCR

	Taq /Amplitaq ®	Ventilación™	Ventilación Profunda™	PFU	Tth	UltMA ™
Vida media de 95 °C	40 min	400 min	1380 min	>120 min	20 min	>50 min
Velocidad de extensión (nt/seg)	75	>80	?	60	>33	?
Finales resultantes	3' A	> 95% contundente	> 95% contundente	contundente	3' A	contundente
Desplazamiento de cadena		+	+
5'® 3' exo	+				+
3'® 5' exo		+	+	+		+

Imprimaciones

Diseño de imprimación

• Generalmente, los cebadores utilizados son de 20 a 30 mer de longitud. Esto proporciona temperaturas prácticas de hibridación (del régimen de alta temperatura donde la polimerasa termoestable es más activa).
• Los cebadores deben evitar tramos de secuencias de polibases (por ejemplo, poli dG) o motivos repetitivos, estos pueden hibridarse con registros inapropiados en el molde.
• Deben evitarse las secuencias de repetición invertidas para evitar la formación de estructura secundaria en el cebador, lo que impediría la hibridación con el molde
• Deben evitarse las secuencias complementarias a otros cebadores utilizados en la PCR para evitar la hibridación entre cebadores (particularmente importante para el extremo 3' del cebador)
• Si es posible, el extremo 3' del cebador debe ser rico en bases G, C para mejorar la hibridación del extremo que se extenderá
• La distancia entre los cebadores debe ser inferior a 10 Kb de longitud. Típicamente, se observa una reducción sustancial en el rendimiento cuando los cebadores se extienden entre sí más allá de ~3 Kb.

Temperatura de fusión (Tm) de las imprimaciones

• La Tm de hibridación del cebador se puede calcular usando diversas fórmulas. La fórmula más utilizada es:

(1) Tm = [(número de residuos A+T) x 2 °C] + [(número de residuos G+C) x 4 °C]

• Ejemplos de cálculos de T _m

	G	A	T	C	T m
15 mer	3	5	2	5	46
20 mer	6	5	4	5	62
30 mer	8	6	8	8	92

Si la temperatura de hibridación es demasiado alta, los cebadores no se hibridarán. Si es demasiado bajo, puede producirse un cebado erróneo en sitios de una secuencia de ADN similar al sitio de unión al cebador pretendido

Análisis del experimento de PCR

• 25-30 ciclos son comunes
• El producto principal debe ser una molécula de ADN dúplex cuyos extremos 5' y 3' están definidos por los dos cebadores de PCR
• Sin embargo, se pueden producir otros productos. Estos a menudo representarán productos de sitios de cebado secundario (cebado erróneo) o errores de incorporación errónea de la polimerasa
• Así, el producto de PCR puede ser heterogéneo y debe separarse y analizarse
• La electroforesis en gel de agarosa, en combinación con tinción con bromuro de etidio, es el método más común para separar y analizar productos de PCR