16.5: Explosión de imprimación
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Primer-Blast es una combinación de un programa llamado Primer3 que ayuda en el diseño de cebadores con propiedades específicas y BLAST. Primer-Blast permite la construcción de cebadores para qPCR donde el usuario puede especificar la temperatura de fusión, reducir la cantidad de autocebado y ampliar las uniones exón-exón para evitar la amplificación del ADN genómico contaminante. Después del diseño de los cebadores, cada par de cebadores se envía a BLAST para identificar si también se cebarán y amplificarán productos similares dentro del genoma del organismo modelo. Este proceso asegura que los cebadores diseñados caigan dentro de sus parámetros de diseño y muy probablemente solo amplifiquen su gen de interés.
- Ingresar la secuencia O el número de acceso del NCBI para el gen de interés.
- Defina la longitud del producto de PCR.
- Limitar el producto entre 100-500 permite una buena eficiencia en qPCR.
- Es posible que los productos más largos no se repliquen de manera eficiente según su protocolo de ciclismo.
- Definir la temperatura de fusión deseada (T m) de los cebadores (la mínima, óptima, máxima, diferencia entre el conjunto).
- 60ºC es bastante alto y ayudará a mejorar la especificidad del cebador con la diana durante la amplificación para evitar el cebado falso.
- Trate de tener los T m lo más cerca posible para que estén recociendo aproximadamente por igual.
- Elija la opción “La imprimación debe cubrir una unión exón-exón”.
- Esto ayuda a amplificar el ADNc y no el ADN genómico que puede ser contaminante.
- No seleccione esto si se trata de un solo gen exón ya que este fallará.
- Seleccione el ARNm de Refseq como la base de datos en la que desea buscar.
- Refseq proporciona secuencias a secuencias de origen natural.
- Cosas como secuencias plasmídicas o construcciones vectoriales no aparecen en Refseq.
- Selecciona el organismo contra el que estás volando.
- Hay opciones para organismos modelo así como líneas celulares.
- Si estás usando algo así como células PC12, puedes usar el genoma de Rattus norvegicus o PC12 ya que eso también es una opción en la base de datos.
- Evaluar la ubicación de los cebadores y los demás parámetros. Generalmente elegimos cebadores en el extremo 3" del ARN ya que las reacciones de RT a menudo tienen un sesgo de 3" en eucariotas mediante el uso de cebado oligo-dT en la transcripción inversa.
