1.10: Función enzimática

Objetivos de aprendizaje

Metas:

• Realizar un ensayo colormétrico para monitorear la actividad de amilasa.

Resultados de aprendizaje de los estudiantes:

Al finalizar este laboratorio, los estudiantes serán capaces de:

• Describir cómo funciona una enzima.
• Explicar el efecto que tiene la temperatura sobre la velocidad de las reacciones químicas.
• Explicar el efecto del pH sobre la actividad enzimática.

Introducción

Los organismos vivos sostienen las actividades de la vida realizando miles de reacciones químicas cada minuto. Estas reacciones no ocurren al azar, sino que son controladas por catalizadores biológicos llamados enzimas. Las enzimas aceleran la velocidad de las reacciones químicas al disminuir la energía de activación necesaria para desencadenar la reacción. Sin enzimas, las reacciones químicas no se producirían lo suficientemente rápido como para soportar la vida. Las enzimas son típicamente proteínas y cada una está compuesta por una secuencia específica de aminoácidos. Los enlaces de hidrógeno se forman entre aminoácidos específicos y ayudan a crear la forma tridimensional que es única para cada enzima. La forma de una enzima, particularmente su sitio activo, dicta la especificidad catalítica de una enzima particular. Cada enzima solo se unirá con moléculas específicas, ya que estas moléculas deben encajar con el sitio activo de la enzima como una cerradura y una llave.

Una molécula que se une con una enzima y sufre un reordenamiento químico se llama sustrato. La enzima “E” se combina con la molécula o moléculas sustrato “S” en el sitio activo y forma un complejo enzima-sustrato temporal “ES”, donde se produce la reacción específica. La molécula sustrato modificada es el producto “P” de la reacción. El producto se separa de la enzima y luego es utilizado por la célula o el cuerpo. La enzima no es consumida ni alterada por la reacción y puede ser utilizada en otras reacciones catalíticas siempre y cuando se disponga de moléculas de sustrato adicionales.

Reacción 1

\[\ce{E + S -> ES -> E + P}\nonumber\]

Una molécula enzimática individual puede facilitar varios miles de reacciones catalíticas por segundo, y por lo tanto solo se necesita una pequeña cantidad de enzima para transformar grandes cantidades de moléculas de sustrato en producto. La cantidad de una enzima particular que se encuentra en una célula en un momento dado es relativa a la velocidad a la que se sintetiza la enzima en comparación con la velocidad a la que se degrada. Si no hay enzima presente, la reacción química catalizada por esa enzima no ocurrirá a una velocidad funcional. Sin embargo, cuando la concentración de la enzima aumenta, la velocidad de la reacción catalítica aumentará siempre y cuando las moléculas de sustrato sean accesibles.

Diversos factores pueden inactivar o desnaturalizar las enzimas alterando su forma tridimensional e inhibiendo su eficiencia de unión al sustrato. Muchas enzimas funcionan mejor dentro de un rango estrecho de temperatura y pH ya que cambios sustanciales en la temperatura o el pH interrumpen sus enlaces de hidrógeno y alteran su forma. El cambio en la forma de la enzima normalmente altera la forma del sitio activo y afecta su capacidad para unirse con moléculas de sustrato. Es el patrón de unión estructural único de una enzima que determina su sensibilidad al cambio de temperatura y pH.

En el siguiente ejercicio explorarás los efectos del pH y la temperatura sobre la actividad de la enzima amilasa. La amilasa se encuentra en la saliva de humanos y otros animales que consumen almidón como parte de su dieta. El almidón es un polisacárido vegetal compuesto por muchas moléculas de glucosa unidas entre sí. La amilasa controla la digestión inicial del almidón al descomponerlo en moléculas de maltosa de disacárido. La maltosa se descompone finalmente en moléculas de glucosa en el intestino delgado cuando se utilizan otras enzimas.

Figura 1: Estructura de ramificación del almidón.

La velocidad a la que el almidón se digiere en maltosa es una medida cuantitativa de la reacción enzimática. La tasa de degradación del almidón es relativa a la velocidad a la que se produce la maltosa, sin embargo es más fácil probar la presencia de almidón que medir la tasa de producción de maltosa. I ₂ KI se utilizará como indicador de la presencia de almidón. Cuando el almidón está presente, I ₂ KI se vuelve de color azul-negro. En presencia de maltosa, I ₂ KI no reaccionará y sigue siendo de color ámbar.

Reacción 2

\[ Starch + I_2KI \rightarrow \text{Dark Blue-Black color} \nonumber\]

Reacción 3

\[ Maltose + I_2KI \rightarrow \text{Amber color} \nonumber\]

Su grupo será asignado para llevar a cabo una o más de las siguientes actividades (en parte o en su totalidad):

I. El efecto del pH sobre la actividad de la amilasa

II. El efecto de la temperatura sobre la actividad de la amilasa

Los resultados de cada ejercicio se presentarán a la clase y los alumnos serán responsables de la información y resultados de todos los ejercicios.

Parte I: El efecto del pH sobre la actividad de amilasa

Cada enzima tiene un pH óptimo al que es la más activa o efectiva. Un cambio en el pH puede alterar los enlaces de la forma tridimensional de una enzima y hacer que la enzima cambie de forma, lo que puede ralentizar o prohibir la unión del sustrato al sitio activo. Determinarás cómo el pH afecta la actividad de amilasa en este ejercicio.

Antes de comenzar este experimento, formule una hipótesis que desee probar y una predicción para evaluar su hipótesis y escríbelas en la hoja de datos al final del ejercicio.

Materiales

• Tubos de ensayo
• Bufferes (pH: 1.0, 5.0, 10.0)
• Micropipetas
• Puntas de pipeta estériles
• 1% de solución de almidón
• I ₂ KI solución
• Placa de pozo
• Solución de amilasa al 0,5%
• Temporizador

Procedimiento

1. Etiquetar 3 tubos de ensayo #1 - #3. Comenzando con el tubo #1 y pH 1, marque un tubo con cada uno de los siguientes pH de tampón: 1.0, 5.0 y 10.0 (Ver Tabla 1 a continuación). Después de marcar los tubos de ensayo, use una micropipeta P-1000 y agregue 4.0 mL del tampón apropiado a cada tubo de ensayo (4.0 mL pH 1.0 tampón al tubo #1, 4.0 mL de tampón pH 5.0 al tubo #2, etc). Asegúrese de colocar una nueva punta en la micropipeta para cada tampón.

   

   Figura 2. Placas de pozo

2. Usando una micropipeta P-1000, agrega 2.0 mL de la solución de almidón al 1% a cada tubo y mezcla girando suavemente el tubo y golpeando la parte inferior del tubo contra tu palma.
3. Colocar 2 gotas de I ₂ KI en los compartimentos de varias filas de la placa de prueba para que 24 compartimentos tengan líquido ámbar transparente en ellos.
4. Comenzando con Tube #1 solo por ahora, haz lo siguiente:
5. Usando una punta nueva y limpia en una micropipeta P-200, extraigan 50.0 microlitros de líquido del tubo de ensayo y dispensar en el primer compartimento de la placa de ensayo que contiene I ₂ KI. La mezcla debe tornarse azul oscuro o negra. (Esto confirma que el almidón está presente en su tubo de ensayo antes de agregar la enzima al tubo).
   • ¡No toques el I2KI con la Punta de Pipeta!
   • Si lo haces, expulsa la punta y cámbiala a una nueva limpia.
6. Agregar 400.0 µL de solución de amilasa al 0.5% usando una micropipeta P-1000. Comienza a grabar el tiempo en segundos en el momento en que se agrega la amilasa. Mezcle el contenido del tubo girando el tubo y golpeando suavemente la parte inferior del tubo contra su palma. Continúe al siguiente paso inmediatamente (dentro de los 20 segundos).
7. Exactamente a los 20 segundos, transfiera 50.0 µL (usando su micropipeta P-200) de la mezcla de reacción del tubo #1 al siguiente compartimento nuevo que contiene I ₂ KI en la placa de ensayo.
   • ¡No toques el I2KI con la Punta de Pipeta!
   • Puede continuar usando el mismo tip para el paso 8 a continuación siempre y cuando permanezca sin contaminar.
8. Repita el paso 7 cada 20 segundos usando el siguiente compartimento nuevo en la placa de prueba. Continuar hasta que ya no se produzca un color azul-negro y la solución I ₂ KI permanezca ámbar (lo que indica que no queda almidón). Después contar el número total de compartimentos que sí cambiaron de color más sobre eso no cambiaron colores y se multiplicaron por 20. Registrar el tiempo requerido para la digestión completa del almidón en el Cuadro 1.
   
   Si el color del I ₂ KI continúa cambiando a un color más oscuro después de un total de 8 minutos de prueba, deje de probar esa mezcla de reacción, registre 480 segundos como tiempo en la tabla de datos y continúe con el paso 9.
   
9. Repita los pasos 5 - 8 usando el tubo #2 y luego #3. Es posible que deba limpiar su placa de prueba enjuagándola con agua DI, secándola con golpecitos y luego agregando I ₂ KI frescos a los compartimentos.

Tabla de datos 1

Tubo	pH	Tiempo de Digestión del Almidón (seg)
1	1
2	5
3	10

Análisis de datos

1. ¿Cómo interpretaría los resultados que se muestran en la Tabla 1?

Parte II: El efecto de la temperatura sobre la actividad de amilasa

Las reacciones químicas se aceleran a medida que aumenta la temperatura. Un aumento de 10 ^o C en la temperatura generalmente resulta en un aumento de dos a tres veces en la velocidad de reacción. Sin embargo, a altas temperaturas las proteínas pueden desnaturalizarse irreversiblemente y se prohíbe la unión al sustrato. La actividad de una enzima depende de su estructura apropiada, y la temperatura óptima para la actividad puede variar dependiendo de la estructura de la enzima.

Antes de comenzar este experimento, formula una hipótesis que desees probar y una predicción que pueda ser utilizada para evaluar tu hipótesis. Escríbelos en la ficha técnica al final del ejercicio.

Materiales

• Tubos de ensayo
• Micropipetas
• Puntas de pipeta estériles
• Agua DI
• Baño de agua caliente (80 ^o C y 37 ^o C)
• Baño de hielo (4 ^o C)
• 1% de solución de almidón
• I ₂ KI solución
• Placa de pozo
• Solución de amilasa al 0,5%
• Temporizador

Trámites

1. Etiquetar 3 tubos de ensayo #1 - #3.
2. Usando una micropipeta P-1000, agregue 1.0 mL de solución de almidón al 1% a cada tubo.
3. Con una nueva punta en su micropipeta P-1000, agregue 3.0 mL de agua DI a cada tubo.
4. Usando una nueva punta en su micropipeta P-1000, agregue 1.0 mL de tampón pH 5.0 a cada tubo.
5. Colocar los tubos de ensayo de la siguiente manera: Tubo #1 en baño de agua de 80 ^o C, Tubo #2 en baño de agua a 37 o C (o incubadora), Tubo #3 en hielo picado (4 ^o C).
6. Deje que los 3 tubos se asienten en los ambientes especificados durante al menos 15 minutos.
7. Colocar 2 gotas de I ₂ KI en los compartimentos de varias filas de la placa de prueba para que 24 compartimentos tengan líquido amarillo claro en ellos.
8. Comenzando con el tubo #1, haga lo siguiente:
9. Usando una CLEAN NEW TIP en una micropipeta P-200, extraigan 50.0 microlitros de líquido del tubo de ensayo y despúyenlo en el primer compartimento de la placa de ensayo que contiene I ₂ KI. La mezcla debe tornarse azul oscuro o negra. (Esto confirma que el almidón está presente en su tubo de ensayo antes de agregar la enzima al tubo). ¡NO TOCAR EL I ₂ KI CON LA PUNTA DE PIPETILLA! Si lo haces, expulsa la punta y cámbiala a una nueva limpia.
10. Agregar 400.0 µL de solución de amilasa al 0.5% usando una micropipeta P-1000. Comienza a grabar el tiempo en segundos en el momento en que se agrega la amilasa. Mezcle el contenido del tubo girando el tubo y golpeando suavemente la parte inferior del tubo contra su palma. Continúe con el siguiente paso inmediatamente (dentro de los 20 segundos)

IMPORTANTE! ¡Deja los tubos en sus ambientes de temperatura mientras están siendo probados!

11. Exactamente a los 20 segundos, transfiera 50.0 µL (usando su micropipeta P-200) de la mezcla de reacción del tubo #1 al siguiente compartimento nuevo que contiene I ₂ KI en la placa de ensayo.
    • ¡No toques el I2KI con la Punta de Pipeta!
    • Puede continuar usando el mismo tip para el paso 8 a continuación siempre y cuando permanezca sin contaminar.
12. Repita el paso 11 cada 20 segundos usando el siguiente compartimento nuevo en la placa de prueba. Continuar hasta que ya no se produzca un color azul-negro y la solución I ₂ KI permanezca ámbar (lo que indica que no queda almidón). Después contar el número total de compartimentos que sí cambiaron de color más sobre eso no cambiaron colores y se multiplicaron por 20. Registrar el tiempo requerido para la digestión completa del almidón en el Cuadro 2.
13. Si el color del I ₂ KI continúa cambiando a un color más oscuro después de un total de 8 minutos de prueba, deje de probar esa mezcla de reacción, registre 480 segundos como tiempo en la tabla de datos y continúe con el paso 9.
14. Repita los pasos 9 - 13 usando el tubo #2 y luego #3. Es posible que deba limpiar su placa de prueba enjuagándola con agua DI, secándola con golpecitos y luego agregando I ₂ KI frescos a los compartimentos.

Tabla de datos 2

Tubo	Temperatura (^o C)	Tiempo de Digestión del Almidón (seg)
1	80
2	37
3	4

Análisis de datos

¿Cómo interpretaría los resultados que se muestran en la Tabla 10.2?

Preguntas de Estudio

1. ¿Cómo acelera una enzima una reacción química?
2. ¿Qué factores pueden desnaturalizar una proteína? ¿Cómo?
3. ¿Qué reacción cataliza la amilasa?
4. Explicar el ensayo colormétrico utilizado para monitorear la actividad de amilasa.