1.11: Caso de Paternidad con Electroforesis

Objetivos de aprendizaje

Metas:

• Ejecutar electroforesis en gel de agarosa en muestras.
• Aprende a analizar las huellas de ADN.

Outomes de Aprendizaje Estudiantil:

Al finalizar este laboratorio, los estudiantes serán capaces de:

• Separar las moléculas por electroforesis.
• Analizar las bandas resultantes de la electroforesis en gel.
• Determinar la paternidad de la descendencia mediante el análisis de huellas de ADN.

Parte I: Electroforesis en gel de agarosa

Introducción

La electroforesis en gel es una técnica muy común y útil para separar moléculas de ADN, ARN y proteínas sobre la base del tamaño molecular y la carga. La agarosa es un polisacárido, que se encuentra en las algas marinas, que forma una matriz de gel (malla de agujeros de varios tamaños). Cuando se pasa una corriente eléctrica a través del tampón y el gel, las moléculas en la muestra se mueven hacia el electrodo con la carga opuesta. Las moléculas de ADN, ARN y proteína suelen tener una carga global negativa y se moverán hacia el electrodo positivo. Las moléculas más pequeñas pueden moverse a través de la matriz del gel más rápido que las moléculas más grandes.

Las huellas de ADN utilizan patrones de banda que resultan del tratamiento específico de muestras de ADN para identificar la relación de una muestra con las muestras de referencia. En este laboratorio, realizarás una simulación de una actividad de huellas dactilares de ADN para familiarizarte con este proceso. Cargará muestras en un gel y separará las bandas en cada muestra para crear patrones específicos usando electroforesis en gel.

Preparación de geles de agarosa

Hay varios tampones de ejecución que se pueden usar para separar el ADN. Algunos de los tampones comúnmente utilizados se llaman TAE (Tris Acetato EDTA), TBE (Tris Borato EDTA) y SB (Borato de Sodio). Siempre use el mismo tampón para hacer el gel de agarosa y ejecutar la electroforesis.

MATERIALES

• Agarosa en polvo
• Espátula
• Embarcación de pesaje
• 20x stock
• Cilindros graduados
• PipetAid
• Pipeta serológica
• Frasco con tapa ventilada

EQUIPOS

• Saldo
• Microondas

PROCEDIMIENTO

1. Preparar 500 ml de tampón de borato de sodio 1X a partir de una solución madre 20X.
   1. Medir 25 mL de solución tampón 20X de Borato de Sodio en un cilindro graduado de 25 mL y verter en un recipiente de 500 mL.
   2. Medir 475 mL de DI-agua en un cilindro graduado de 500 mL y verter en el mismo recipiente.
   3. Tapar bien y mezclar.
2. Preparar 50 ml de agarosa 0.8% (p/v) en tampón de borato de sodio 1X para verter cuatro geles Mini One. Tenga en cuenta que la agarosa (y la gelatina) son dos sustancias que se preparan de manera especial, ya que solo pueden disolverse en líquidos hirviendo. Entonces, NUNCA ponemos polvo de agarosa (y gelatina) en cilindros graduados. En su lugar vertimos el polvo en el recipiente final (matraz Erlenmeyer).
   1. Medir 50 mL de tampón 1X con un cilindro graduado de 50 mL y verter en un matraz Erlenmeyer.
   2. Mida 0.4 g de agarosa en polvo y vierta en el mismo matraz. Esto se verá como una suspensión opaca.
   3. Use una tapa ventilada si es posible (o sin tapa). Coloque el matraz en un horno microondas y enciéndalo (por 1 minuto) a temperatura alta. Mantenga una estrecha vigilancia - ¡no permita que el líquido hierva!
   4. Esté atento al burbujeo del líquido. Tan pronto como el líquido empiece a burbujear, detenga el microondas, use manoplas o silicona “Manos Calientes” para remolinar el matraz 2-3 veces.
   5. Después reemplace y vuelva a encender el microondas para el segundo hervor.
   6. Tan pronto como el líquido empiece a burbujear, detenga el microondas, use manoplas o “Manos Calientes” para sujetar el matraz a la luz del techo. Busque cuidadosamente cualquier mota o cristal en el líquido. Cuando no hay más motas visibles en la solución transparente, entonces la agarosa se ha derretido completamente.
   7. Colocar el matraz sobre la mesa y dejar enfriar a 60oC. Cuando por primera vez puedas sostener el matraz con las manos desnudas, entonces la agarosa está lo suficientemente fría como para verterla en charolas. No vierta la agarosa demasiado caliente, ya que los geles de fundición se deformarán y crepitarán. No enfríe la agarosa demasiado tiempo, ya que el gel no polimerizará uniformemente.
   8. Prepare las bandejas de fundición y practique cargar muestras de gel mientras espera.

Fundición de geles de agarosa (MINI ONE EMBITEC GEL SYSTEM)

1. Coloque dos charolas de fundición de acrílico transparente en el soporte de fundición blanco.
2. Inserte el peine de 9 pocillos en la ranura adecuada del soporte de fundición.
3. Lo mejor es usar una Pipet-Aid y una Pipeta Serológica de 25 mL para medir y transferir 12.5 mL de solución de agarosa fundida a cada bandeja de colada. O vierta la solución de agarosa hasta 1/3 arriba del peine.
4. Mueva o haga explotar rápidamente las burbujas de aire con una punta de pipeta o un peine de gel. Inserte el peine de gel en la ranura adecuada.
5. No mueva ni golpee la bandeja de gel hasta que el gel se haya solidificado en aproximadamente 15 minutos.
6. Almacene la solución extra de agarosa en un matraz, cubierto con parafilm o tapa, a 4oC para su uso posterior.

Práctica de carga de muestras de gel

¡Cargar muestras de gel es una habilidad que requiere práctica para aprender! El gel de agarosa real que vas a utilizar para la electroforesis es muy delicado y se puede perforar fácilmente. El gel de práctica no se puede perforar, pero proporciona pozos del mismo tamaño para dispensar sus muestras. Como el ADN es claro, generalmente se agrega un colorante de carga coloreado a las muestras de ADN. También se agrega glicerol de alta densidad al colorante de carga, de manera que las muestras de ADN caerán al fondo del pozo rápidamente.

Consejo de laboratorio: Al cargar muestras en los pocillos de gel, solo empuje el émbolo de la micropipeta hasta el primer tope, NO empuje hasta el segundo tope. Asegúrese de mantener su pulgar presionado sobre el émbolo, hasta que la micropipeta esté completamente fuera del tanque de amortiguación.

1. Obtener un gel de uretano de práctica.
2. Cubrir el gel con agua desionizada. Si hay burbujas en los pozos, use una pipeta de transferencia de plástico para eliminar las burbujas.
3. Use una punta de pipeta en una micropipeta P20 y ajuste el dial a 10.0 uL.
4. Empuje y sostenga el émbolo de la micropipeta hasta el primer tope.
5. Toma 10 µL del tinte rojo de práctica y suelta lentamente tu pulgar.
6. Sostenga la micropipeta verticalmente (ver Figura 1) sobre el gel de práctica, tal que la punta esté por debajo del nivel del agua y justo por encima del pozo. No hay necesidad de punta para entrar en el pozo, ya que el glicerol pesado arrastrará la muestra hacia abajo en el fondo del pozo.

   

   Figura 1. El correcto posicionamiento de una punta de micropipeta

7. Empuje el émbolo hasta el FIRST STOP solamente y mantenga su pulgar allí. (Opcional: intenta empujar a la segunda parada para ver qué pasa.)
8. Mueve todo el brazo hacia arriba, para que la micropipeta quede fuera del agua, luego deja que tu pulgar se salga del émbolo. (Opcional: intenta soltar el pulgar mientras la pipeta aún está en el agua para ver qué pasa).
9. Practica la carga de 10.0 µL del tinte rojo en tres o más pocillos del gel de práctica.
10. Debería poder ver la muestra coloreada descendiendo hasta el fondo de los pozos.

Consejo de laboratorio: Si se hace correctamente, toda la muestra permanecerá en el pozo. Verifique si hay algún tinte coloreado flotando lejos de la parte superior del pozo, lo que significa que la muestra puede contaminar otro pozo. Verifique si hay algún tinte que se escapa del fondo del pozo, lo que significa que perforó el pozo y es posible que la muestra no ingrese al gel.

PARTE II: Caso de paternidad: ¿Quién es el padre de mis gatitos?

Mary tiene un gato blanco llamado “Honey” que estuvo perdido por dos días hace unos tres meses. Ahora tiene cuatro gatitos (foto 1) y Mary quiere saber si los dos gatos vecinos, “Tom” o “Butch”, podrían ser el padre de cada gatito. Para analizar su huella de ADN, Mary ha recolectado folículos pilosos de cada gato y gatito adultos, extraído ADN y amplificado ADN usando la reacción en cadena de la polimerasa.

Figura 2: De izquierda a derecha. Miel y sus cuatro gatitos (en orden): Crema, Melaza, Jengibre, Azúcar; padres potenciales Tom y Butch.

Hipótesis

Usando la foto, completa la tabla 1 con tu predicción del padre de cada gatito.

Cuadro 1. Hipótesis sobre la paternidad de gatitos

Gatito	Padre Potencial	Razonamiento
Crema
Melaza
Jengibre
Azúcar

Materiales

Reactivos

• Gel de agarosa prefabricado 0.8%
• Siete muestras en tubos de microcentrífuga. Uno por cada felino
• 135-150 mL 1X tampón de ejecución de borato de sodio (suficiente para sumergir el gel de agarosa)

Equipo y Suministros

• Sistema de electroforesis como MiniOne u otra marca con la cámara de gel y fuente de alimentación
• Micropipetas P-20 y puntas apropiadas
• Teléfono celular o cámara para fotografiar el gel para documentar resultados

Procedimiento

1. NOTA: Se completa lo siguiente cuando la cámara de electroforesis ha sido preparada con un gel de agarosa 0.8% y 1x tampón de Borato de Sodio en la cámara. No olvide documentar su procedimiento adecuadamente en su cuaderno de laboratorio.
2. Obtener las “muestras de ADN” — hay siete tubos de microcentrífuga etiquetados P- V.
3. Usando una micropipeta P-20 y una punta de pipeta, mida 10 µL del Tubo P y transfiérala al primer pocillo del gel de agarosa. Asegúrese de seguir el orden de carga de gel indicado en la Columna 1 — Bien.
4. Usando una nueva punta para cada muestra, transfiera 10µL de cada muestra a nuevos pocillos del gel.
5. Asegúrese de realizar un seguimiento de la carga de su muestra, si no sigue la tabla a continuación. Si hubo algún problema con la carga (gel perforado, no muestra suficiente), asegúrese de escribir en la columna NOTE.

Cuadro 2. Notas de carga: Incluye cualquier desviación o nota en tu cuaderno de laboratorio

Bueno	Tubo	Muestra de ADN 10µL	Notas para cargar
1	P	Tom (masculino)
2	Q	Crema (gatito)
3	R	Melaza (gatito)
4	S	Miel (hembra)
5	T	Jengibre (gatito)
6	U	Azúcar (gatito)
7	V	Butch (masculino)

6. Si usa un sistema de electroforesis MiniOne, ejecute el gel durante 15 minutos, hasta que las bandas de color se separen. Si usa otro sistema de electroforesis, ejecute el gel a 135V hasta que el frente de tinte esté.
7. Para una mejor visualización de los resultados, saque la bandeja de colada (con gel) del tanque de amortiguación, deslice el gel sobre un papel laminado blanco, etiquete las muestras (y el nombre de su equipo) y tome una foto.
8. Debido a que las muestras de ADN se difundirán a través de los geles de agarosa, siempre se deben registrar los resultados rápidamente una vez que se haya apagado la electroforesis.

ANÁLISIS

1. Use lápices de colores para grabar los patrones de banda (colorea los bloques apropiados) en la Tabla de Datos a continuación.

Cuadro 3. Bandas de “ADN” coloreadas separadas por electroforesis en gel de agarosa

Tubo	P	Q	R	S	T	U	V
Banda	Tom (Masculino)	Crema	Melaza	Miel (Femenino)	Jengibre	Azúcar	Butch (Masculino)
Azul #1
Azul #2
Rosa #1
Morado #1
Amarillo #1
Amarillo #2

2. Considere cuidadosamente cada banda de las cuatro muestras de gatitos y determine si la banda coincide con Tom, Honey o Butch. Para las muestras de gatitos (columnas QRTU) en la Tabla de Datos 3, escribe (dentro de los bloques de colores) quién coincide con esa banda: Tom, Honey o Butch.
3. Saque sus conclusiones con base en la “evidencia de ADN”.
4. Rellene la 2da y 3ª columna en la tabla 4 a continuación. Compara tu hipótesis en la tabla 1 donde adivinaste al padre para cada gatito en base a las apariencias a tu conclusión respecto al padre basado en la evidencia de ADN. ¿Tu hipótesis fue correcta para cada gatito?
5. ¿Cuál es la evidencia específica que justifica tu conclusión determinando al padre de cada gatito? Rellene sus respuestas a estas preguntas en la siguiente tabla.

Cuadro 4. Comparación de hipótesis y conclusión respaldada por evidencia experimental

Gatito	PADRE basado en visual	PADRE basado en ADN	Evidencia
Crema
Melaza
Jengibre
Azúcar

Preguntas de Estudio

1. Durante la electroforesis en gel, ¿el ADN migrará hacia qué electrodo?
2. Si tuvieras moléculas de ADN que fueran pequeñas, medianas, largas y extralargas, ¿cuál sería la más cercana al fondo del gel después de la electroforesis?
3. ¿Qué sabes del patrón de bandas que resultan de una descendencia ya que se relacionan con la madre y el padre?
4. Si realizaste análisis de huellas de ADN pero el patrón de banda para la descendencia no coincidía con ninguno de los padres, ¿qué concluirías?