1.12: Digerición de Restricción con Electroforosis en Gel

Objetivos de aprendizaje

Metas:

• Comprender la función de las enzimas de restricción.
• Realizar análisis de fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel.

Resultados de aprendizaje de los estudiantes:

Al finalizar este laboratorio, los estudiantes serán capaces de:

• Lea un mapa plasmídico para determinar los sitios de restricción y los tamaños de fragmentos.
• Determinar si las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción son palíndromos.
• Predecir los tamaños de los fragmentos de ADN formados después de una digestión de restricción.
• Compara las bandas de electroforesis en gel para determinar los tamaños de ADN.

Introducción

La tecnología de ADN recombinante es posible gracias a varias herramientas útiles para manipular moléculas de ADN y transformar células, incluyendo plásmidos, enzimas de restricción y ADN ligasa. Este laboratorio le presenta plásmidos y enzimas de restricción, así como la técnica de laboratorio de electroforesis en gel. Posteriormente, experimentos de laboratorio te introducirán a las otras herramientas de la biotecnología.

Las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) son proteínas elaboradas por muchas especies bacterianas, para defenderse contra las infecciones virales. Cada enzima de restricción se mueve a lo largo de una molécula de ADN hasta que encuentra una secuencia de reconocimiento específica en el ADN. La enzima corta el ADN bicatenario, dando como resultado fragmentos de ADN. Se han descubierto más de 3000 enzimas de restricción que reconocen secuencias palindrómicas cortas (4-8 pb).

Figura 1. Secuencia de reconocimiento para la enzima Hind III

La Figura 1 muestra la secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción Hind III. Observe que la secuencia de reconocimiento es un palíndromo, y lee lo mismo yendo hacia adelante y hacia atrás. La enzima Hind III realiza un corte escalonado del ADN, y produce fragmentos que tienen áreas monocatenarias llamadas “extremos pegajosos”. La Figura 2 muestra la secuencia de reconocimiento de otras dos enzimas de restricción Sca 1 y Pst 1. La enzima Pst 1 realiza un corte escalonado del ADN en su secuencia de reconocimiento. Pero la enzima de restricción Sca I realiza un corte romo en su secuencia de reconocimiento para generar fragmentos de ADN sin extremos pegajosos.

Figura 2: Sitios de reconocimiento de enzimas de restricción.

Las células bacterianas tienen todos sus genes (genoma) en un solo cromosoma circular. Pero las células bacterianas también pueden portar piezas no esenciales de ADN llamadas plásmidos. Un plásmido es un pequeño ADN circular que es capaz de replicarse, y puede portar algunos genes de célula a célula. Los científicos son capaces de diseñar plásmidos recombinantes para llevar genes específicos a una célula huésped diana.

Figura 3: Mapa plasmídico de pUC19.

El mapa genético de un plásmido “pUC19” se muestra en la Figura 3. El tamaño total del plásmido es de 2686 pb. Hay un sitio de reconocimiento Pst I en la posición 439, el sitio de reconocimiento Hind III en la posición 447 y el sitio de reconocimiento Sca I en 2179. Si se usa una enzima de restricción para cortar el plásmido pUC19, ¿qué se produciría?

Determinar qué fragmentos de ADN se producen cuando se utilizan dos enzimas de restricción para cortar el ADN plasmídico pUC19.

Cuadro 1. Fragmentos de ADN previstos a partir de la digestión de restricción del plásmido pUC19

Corte con enzimas de restricción	Sca I y Pst I	Sca I y Hind III	Pst I y Hind III
Tamaños de fragmentos de ADN resultantes

Parte I: resumen de restricción

El agar es un polisacárido derivado de algas rojas. El polvo de agar se disuelve primero en un líquido hirviendo y luego se enfría para formar una matriz sólida gelatinosa. Como los microbios no pueden digerir el agar, este material se usa comúnmente en laboratorios para contener los nutrientes que las bacterias necesitan.

Materiales

• Micropipeta P-20
• Caja de puntas de pipeta desechables
• Limpiar los tubos de microcentrífuga
• Rack para tubos para microfugas
• Marcador permanente
• Contenedor de residuos para puntas usadas y tubos de microcentrífuga
• Tubos de microcentrífuga que contienen:
• ADN plasmídico pUC19
• ADN plasmídico pPUS2
• enzima de restricción Pst 1
• Enzima de restricción Sca 1
• Buffer de restricción
• Agua desionizada

Equipo

• Microcentrífuga
• Baño de agua a 37 ^o C (o baño seco o incubadora)

Método

1. Usa un Sharpie para etiquetar la parte superior y lateral de 3 tubos de microcentrífuga limpios A B C y el nombre de tu grupo.
2. Siga la tabla de reactivos a continuación y dispense las cantidades adecuadas de reactivos a los tubos etiquetados. Usa nuevas puntas para diferentes reactivos. Añadir reactivos a la solución en la parte inferior del tubo. Siempre verifique que la punta de su pipeta esté vacía después de dispensar el reactivo.

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Cuadro 2. Volúmenes de reactivos para agregar a cada tubo

Tubo	ADN	Pst 1	Sca	Buffer de restricción	Agua
A	4 µL de PPUS2	2 uL	ninguno	4 uL	ninguno
B	4 µL de pUC19	2 uL	2 uL	2 uL	ninguno
C	4 µL de pUC19	2 uL	ninguno	4 uL	ninguno
D	4 µL de pUC19	ninguno	ninguno	ninguno	6 uL

3. Tapar los tubos firmemente Coloque dos tubos directamente uno frente al otro en la microcentrífuga.
4. Girar durante cinco segundos para llevar todos los reactivos al fondo de cada tubo.
5. Coloque los tubos en una rejilla flotante en el baño de agua a 37°C durante al menos una hora (pero no más de dos horas).
6. Una vez finalizado el periodo de incubación, analizará los contenidos mediante electroforesis en gel en la Parte IV.

Parte II: Fundición de gel de agarosa

La agarosa es un carbohidrato complejo que se encuentra en las algas marinas. Si la agarosa se disuelve en un líquido hirviendo y luego se enfría, la solución se convierte en una matriz de gel sólido. La solución de agarosa se verterá en una bandeja de colada para formar la forma de gel deseada. Un peine de gel tiene dientes que se utilizan para formar los “pozos” u orificios para cargar las muestras. Se le preparará y echará un gel de agarosa al 1% con tampón de electroforesis.

Materiales

• Agarosa en polvo
• Embarcación de pesaje
• Espátula
• Cinta de enmascarar
• 100 Cilindro graduado
• Frasco Erlenmeyer de 250 mL
• Bandeja de colada de gel de electroforesis
• Peine de gel
• Agua desionizada o destilada
• 1X tampón de electroforesis
• Manoplas o pinzas de silicona resistentes al calor
• Balanza electrónica o analítica
• Microondas

Método

Nota

• Nota: Si tiene stock de tampón de electroforesis concentrado, debe diluir el stock a una concentración de trabajo 1X antes de preparar soluciones de agarosa o ejecutar electroforesis en gel.
• Para stock 20X, combine 25 mL 20X stock con 475 mL de agua desionizada para hacer 500 mL 1X tampón.
• Para stock 50X, combine 10 mL 50X stock con 490 mL de agua desionizada para hacer 500 mL 1X tampón.

1. Usando el cilindro graduado, medir 100 mL del tampón de electroforesis 1X.
2. Usando una báscula electrónica, mida 1.0 g de polvo de agarosa.
3. Vierte parte del tampón medido en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. Vierta el polvo de agarosa medido. Vierte algo del tampón medido en el bote de pesaje de agarosa y vierte en el matraz. Repetir hasta que toda la agarosa haya sido transferida al matraz. Vierte el resto del tampón en el matraz.
4. Cubra la abertura del matraz con una envoltura de plástico. Use una punta de pipeta para hacer un pequeño agujero en la envoltura de plástico.
5. Coloca el matraz tapado en un microondas y calienta a alta. Cuando veas que se forman burbujas en la solución, pausa el microondas, usa manoplas de horno para hacer girar suavemente el matraz unas cuantas veces.
6. Continúe calentando el matraz en el microondas hasta que el líquido empiece a burbujear nuevamente. Usando mitones para horno, sostenga el matraz a la luz y arremoline la solución. Observe cuidadosamente para verificar que no haya motas o remolinos de agarosa suspendidos en el líquido. Si el líquido es transparente, entonces la agarosa se disuelve. Espera cinco minutos para que la agarosa se enfríe. Nota: El instructor anunciará si tiene un sistema de soporte de fundición y no necesita pegar cada bandeja.
7. Prepare las bandejas de gel de electroforesis acrílica para colar. Es posible que deba pegar con cinta los dos extremos abiertos de cada bandeja. Asegúrese de presionar firmemente la cinta adhesiva a lo largo de todo el borde de la bandeja con la uña. Si usa cinta de enmascarar, puede ver una diferencia en la translucidez de la cinta.

Figura 4. Bandeja de fundición con cinta

8. Coloque un peine en cada bandeja antes de agregar la solución de agarosa.
9. Cuando la solución de agarosa se haya enfriado hasta el punto de que pueda tocar con seguridad el fondo del matraz (~60°C; aproximadamente cinco minutos), vierta la solución de agarosa en cada bandeja de colada, de manera que la solución cubra aproximadamente 2 mm de cada peine. Nota: Cada gel Mini One requiere 12.5 mL de solución de agarosa, cada bandeja de colada contiene dos geles = 25 mL total.
10. Una vez que los geles se solidifiquen (lo que tardará alrededor de 30 minutos), saque el peine de cada gel. Tire de él hacia afuera sin moverlo hacia adelante y hacia atrás; esto minimizará el daño a la pared frontal del pozo.

Parte III: Practicar pipeteo

Mientras esperas a que se incube la digestión de restricción, puedes practicar la carga de muestras en un gel de práctica. Como los geles de agarosa son muy fáciles de perforar, es importante contar con una buena técnica para cargar las muestras. Como los pocillos de gel son pequeños, solo empuja la micropipeta hasta la PRIMERA parada para dispensar la muestra. El ADN purificado parece agua, por lo que se agrega un tinte coloreado para asegurar que se pueda ver la carga de la muestra en el pozo. Se agrega glicerol, un líquido viscoso, al colorante de carga para asegurar que la muestra de ADN se hundirá hasta el fondo del pozo.

Figura 5. Pipetear una muestra en el pocillo de un gel de agarosa

Materiales

• Micropipeta P-20
• Caja de puntas de pipeta desechables
• Contenedor de residuos para puntas usadas
• Tubo de colorante color/glicerol
• Gel de práctica de agarosa o poliuretano
• Agarosa en polvo
• Embarcación de pesaje
• Espátula
• Cinta de enmascarar

Método

1. Vea el video o demostración del instructor.
2. Sumerja el gel de práctica con agua o tampón.
3. Practica cargar 5 µL y 10 µL de tinte coloreado en varios pocillos de un gel de práctica. No cambies consejos para esta práctica.
4. Para estabilizar la mano de la pipeta, coloca el codo sobre la mesa. También puede usar la otra mano para apoyar y estabilizar la mano de la pipeta.

Parte IV: Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es una técnica para usar corriente eléctrica para separar una mezcla de moléculas como ADN, ARN y proteínas. El tampón de electroforesis contiene iones para conducir la corriente eléctrica. A medida que las moléculas de ADN están cargadas negativamente, migrarán hacia el electrodo positivo (rojo). La matriz de gel de agarosa solidificada tendrá poros de varios tamaños (similares a una esponja), por lo que el tamaño, forma y carga de las moléculas pueden afectar la velocidad de desplazamiento a través del gel de agarosa. Las moléculas más pequeñas se mueven más rápido que las moléculas más grandes.

Figura 6. La electroforesis hace que las moléculas se separen por tamaño en el gel poroso

El ADN se puede visualizar con diversos tintes. Los científicos suelen utilizar bromuro de etidio (ya sea dentro del gel de agarosa o como post-tinción después de la ejecución del gel). Como el bromuro de etidio es mutagénico, no lo usaremos en nuestra clase. En su lugar, usaremos mancha gel verde, que es compatible con los transiluminadores LED azules (eg. MiniOne). La mancha alternativa es el rojo gel, que funciona con los transiluminadores UV.

Materiales

• Agarosa en polvo
• Embarcación de pesaje
• Espátula
• Cinta de enmascarar
• 100 Cilindro graduado
• Frasco Erlenmeyer de 250 mL
• Bandeja de colada de gel de electroforesis
• Peine de gel
• Agua desionizada o destilada
• 1X tampón de electroforesis
• Manoplas o pinzas de silicona resistentes al calor
• Balanza electrónica o analítica
• Microondas

Método

Configuración de las muestras de ADN

1. Encuentra tus tubos del compendio de restricción (Parte 1).
2. Añadir 2 µL de Gel verde Cargando colorante en cada uno de los tubos de muestra. Pipetear arriba y abajo dos veces para mezclar el líquido.
3. Colocar los tubos en una configuración equilibrada en una MicroCentrifugadora y centrifugar durante cinco segundos.

Configuración del sistema de electroforesis

1. Vea una demostración o videos asignados y siga las instrucciones para colocar la bandeja de gel en el tanque de tampón de electroforesis.
2. Llene el tanque tampón con tampón de electroforesis 1X, asegurando que todo el gel esté completamente sumergido. Quieres una capa líquida de aproximadamente 1 mm por encima del gel, pero no demasiado tampón ya que eso puede acumular resistencia.
3. Comprobar que el gel esté orientado con pocillos de muestra más cercanos al electrodo negativo (negro). Comprueba que el cable de alimentación pueda llegar fácilmente. Verifique que no sea necesario mover la caja de gel durante 30 minutos.
4. Dibuja y etiqueta en tu cuaderno cómo se cargarán las muestras en el gel. Comprueba si compartirás el gel con otro grupo.
5. Usando una nueva punta para cada muestra, cargue las muestras de ADN cuidadosamente en los pocillos de gel.
6. Después de cargar todas las muestras, coloque la tapa sobre la caja de electroforesis. [Nota: El gel verde es especialmente sensible a la luz, así que no dejes la luz Mini One encendida durante la electroforesis].
7. Conecte los cables eléctricos a la fuente de alimentación. Conecte ambos cables al mismo canal, con el negativo (-) cátodo a cátodo (negro a negro) y el positivo (+) ánodo a ánodo (rojo a rojo). [Nota: El sistema Mini One debe tener una capucha naranja en su lugar para encenderse].
8. Encienda la fuente de alimentación y ajuste el voltaje a 130—135 V. [Nota: Los sistemas Mini One no tienen voltaje ajustable].
9. Después de encender la alimentación en las cajas de gel, busque burbujas que se formen en el electrodo negativo (para mostrar corriente eléctrica) y que los tintes se muevan hacia la dirección correcta. Si corre de manera incorrecta, espere hasta que los tintes estén dentro del gel de agarosa, luego gire el gel 180o y reinicie la carrera..
10. No permita que el tinte de carga se escurra del gel. Asegúrese de apagar el interruptor de alimentación y desenchufar los electrodos de la fuente de alimentación. Haga esto agarrando el electrodo en el enchufe de plástico, NO el cable.
11. Retire con cuidado la cubierta de la caja de gel y recoja la bandeja de gel. Deslice el gel sobre una envoltura de plástico en la parte superior del transiluminador apropiado. Toma una foto.
12. Compara los tamaños de la escalera de ADN con los fragmentos de pUC19. El pPSU1 cortado con Pst1 tiene fragmentos de 4100, 2000, 1000, 900, 800, 700 y 500. El corte PpSu2 con Pst tengo tamaños de 4100, 1500, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50.
13. ¿Qué tamaños son los fragmentos de ADN pUC19?

RESULTADOS

Figura 7: Digestos de restricción después de electroforesis

Preguntas de Estudio

1. En la naturaleza, ¿cuál es la función de las enzimas de restricción?
2. ¿Qué es un palíndromo? ¿Cómo se relaciona eso con las enzimas de restricción?
3. ¿Por qué los laboratorios de investigación en biología molecular siempre tienen microondas?
4. ¿Por qué nunca deberías comer en un laboratorio de investigación en biología molecular?
5. ¿Cómo se dispensan muestras en un gel de agarosa?