1.13: Transformación

Objetivos de aprendizaje

Metas:

• Explicar cómo la información codificada en un gen se expresa como un rasgo
• Describir el papel de la transformación en la clonación de genes
• Explicar el propósito de cada control en el experimento de transformación

Resultados de aprendizaje de los estudiantes:

Al finalizar este laboratorio, los estudiantes serán capaces de:

• Llevar a cabo una transformación
• Predecir los resultados de crecimiento para el control negativo y la reacción que contiene plásmido en ambos medios que contienen antibióticos y solo agar nutritivo
• Explica tu razonamiento, si los resultados de crecimiento previstos no coinciden con los resultados de crecimiento reales

Introducción

La ingeniería genética o la tecnología del ADN han sido útiles para producir grandes cantidades de una proteína específica para tratar enfermedades humanas. Por ejemplo, los pacientes con diabetes, hemofilia o anemia requieren tratamientos con insulina, factor de coagulación y proteínas del factor de crecimiento. Los genes dirigidos (ADN) pueden cortarse con enzimas de restricción y unirse con otro ADN con la enzima ligasa. Se utiliza un vector de clonación para llevar el ADN recombinante a las células vivas, de manera que las células puedan sintetizar las proteínas codificadas. Los mejores vectores de clonación son de tamaño pequeño, capaces de replicar su ADN, contienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción y tienen un gen marcador (generalmente gen de resistencia a antibióticos). En este laboratorio, utilizaremos un plásmido recombinante como vector de clonación. Este plásmido recombinante contiene (1) un promotor que permite la transcripción del gen deseado, (2) una secuencia para el inicio de la replicación del ADN (sitio ori) y (3) un gen de resistencia a antibióticos.

Transformación de bacterias con plásmido recombinante

Insertar un gen en un vector plasmídico es un primer paso importante en el proceso de clonación génica. Sin embargo, si el objetivo final es producir una gran cantidad de una proteína en particular, el plásmido debe replicarse para asegurarse de que hay muchas copias del gen y el gen de interés debe expresarse, lo que significa que el gen se utiliza para producir la proteína codificada. Ambas actividades sólo pueden ocurrir dentro de una célula. Por lo tanto, en este laboratorio pondremos un plásmido recombinante en bacterias E. coli a través de un proceso que se llama transformación, llamado así porque cambia el contenido de ADN de la bacteria.

El plásmido será captado por bacterias donde se replica, y sus genes se expresarán utilizando la maquinaria celular bacteriana. Si se ha insertado un gen de interés en el vector plasmídico, la bacteria produce el producto codificado por ese gen.

En este ejercicio, llevarás a cabo la transformación de la bacteria E. coli utilizando un plásmido recombinante que contiene un gen que produce proteínas coloreadas.

Transformación Bacteriana

Una vez que se hace un plásmido recombinante que contiene un gen de interés, como la insulina, el plásmido puede ingresar a las células bacterianas mediante un proceso llamado transformación. La Figura 13.1 ilustra la transformación. La captación de ADN del ambiente de una célula bacteriana ocurre con una eficiencia muy baja en la naturaleza. Las bacterias E. coli tienen membranas plasmáticas complejas que separan el ambiente externo del ambiente interno de la célula y regulan cuidadosamente qué sustancias pueden entrar y salir de la célula. Además, la pared celular está cargada negativamente y repele las moléculas de ADN cargadas negativamente.

Las células que han sido tratadas para ser competentes son más eficientes en la toma de ADN de su entorno circundante. Las células competentes se pueden hacer tratando las bacterias con una solución de calcio. Los iones de calcio están cargados positivamente y neutralizarán la membrana externa cargada negativamente en la bacteria E. coli. Con la carga positiva ahora recubriendo la membrana, las moléculas de ADN inherentemente cargadas negativamente se moverán a través de las membranas plasmáticas y dentro de la célula. La eficiencia de transformación se puede aumentar aún más al estresar las células en un choque térmico. Al cambiar drásticamente la temperatura de las células de frío a cálido, las membranas plasmáticas se vuelven más fluidas y crean poros en ellas. El ADN plasmídico puede viajar desde el ambiente a través de estos poros y entrar en la célula. Luego, las células se sumergen de nuevo en una temperatura fría, lo que hace que los poros se cierren y que el ADN plasmídico permanezca dentro de la célula.

Sin embargo, incluso las células competentes no siempre captan el plásmido. Para algunas moléculas de ADN plasmídico, solo se transformará aproximadamente 1 de cada 10.000 células. Cuando tan pocas células hayan absorbido el plásmido, ¿cómo podrá identificar las células transformadas? Al diseñar un plásmido recombinante, uno de los requisitos es agregar un gen para una resistencia antibiótica. De esta manera, la bacteria se puede cultivar en el medio con un antibiótico agregado a la misma, y solo las células que tengan el gen de resistencia, como las que expresan el plásmido recombinante, podrán crecer.

Figura 1. Transformación bacteriana.

Del ADN plasmídico a la proteína

Después de que un plásmido recombinante ingresa a una célula bacteriana, la célula comienza a expresar los genes en ella. La ADN polimerasa localiza el ori, el origen de la replicación, y comienza a replicar el plásmido usando la maquinaria de la célula bacteriana. Múltiples copias del plásmido recombinante pueden permitir que la célula bacteriana exprese grandes cantidades de una proteína. Por lo general, una célula bacteriana sólo elaborará la proteína de interés, después de que se induzca a hacerlo añadiendo una sustancia química que promoverá la transcripción del gen. Recordemos que para expresar el gen que codifica la proteína en el plásmido recombinante, el ADN se transcribe a ARNm, que luego se traduce en proteína (Figura 13.2). Las proteínas expresadas pueden afectar los rasgos visibles al observar las colonias de bacterias.

Figura 2. Expresión génica a partir de un plásmido en la célula bacteriana

Los plásmidos recombinantes y otras formas de ingeniería genética son posibles porque todos los organismos vivos utilizan el ADN como plataforma para codificar información genética. Los genes de diferentes organismos pueden expresarse en otros organismos como bacterias ya que están codificados en el ADN. Las instrucciones de ADN se pueden transferir, y otros organismos pueden expresar rasgos extraños.

Las proteínas tienen muchas funciones diferentes en el interior y en las células. Están conformadas por subunidades más pequeñas, aminoácidos, que están codificados por nucleótidos de ADN. Una secuencia específica de tres nucleótidos que codifica para un solo aminoácido se llama codón. Por ejemplo, el codón TTG codifica para el aminoácido triptófano, mientras que el codón AAG codifica para el aminoácido lisina. En muchos casos, más de un codón puede codificar el mismo aminoácido. Por ejemplo, AAA es también un codón para lisina. Además, existen codones informativos, como el codón de inicio (ATG) y el codón de parada (TTA), que muestran dónde en la secuencia de ADN comienza y termina el código para la proteína.

Transformación de bacterias con plásmidos

En este experimento de laboratorio transformarás células de bacterias E. coli con plásmidos. Se utilizará E. coli que se ha hecho competente con un tratamiento con cloruro de calcio, y formará dos grupos de prueba diferentes: un grupo de células de control negativo que no tiene plásmidos agregados a él, y el grupo experimental al que se le han agregado los plásmidos. Después de que las células sean sometidas a choque térmico, se cultivarán bajo diversas condiciones de prueba:

• El grupo control en agar nutritivo (un tipo de medio de crecimiento en el que prosperan las bacterias).
• El grupo control sobre agar nutritivo con antibiótico agregado.
• El grupo experimental sobre agar nutritivo.
• El grupo experimental sobre agar nutritivo con antibiótico.
• El grupo experimental sobre agar nutritivo, antibiótico y un inductor (como IPTG).

Al examinar el crecimiento de bacterias en estas condiciones, puedes verificar que tu procedimiento funcionó, y puedes identificar las bacterias transformadas con el plásmido agregado. ¿Cómo sabrás si tienes éxito? En los ejemplos de plásmidos que hemos recomendado para este ejercicio, las bacterias recombinantes tendrán un rasgo nuevo y altamente visible: Ahora producirá proteína coloreada, ¡lo que hace que las células mismas sean coloreadas! A medida que las bacterias se multiplican en los medios, forman colecciones visibles de células llamadas colonias. Cada colonia representa a los fallecidos de la célula bacteriana original que aterrizó en ese punto en el medio y comenzó a replicarse. Así, las colonias son clones (copias exactas) de la célula que inició el proceso de replicación.

Los componentes relevantes de su plásmido son el gen para la proteína coloreada, el promotor inducible y el gen de resistencia a ampicilina (ampR). El gen ampR confiere resistencia al antibiótico ampicilina. (Los biotecnólogos llaman a estos genes marcadores seleccionables porque solo las bacterias que tienen el gen sobrevivirán en presencia de un antibiótico). Si el inductor está presente en la bacteria, el promotor se “encenderá” para que la ARN polimerasa pueda transcribir el gen de interés. Esto permitirá que se produzca proteína.

Preguntas sobre Prelab

Discutan entre ustedes los siguientes. Prepárate para compartir tus pensamientos con el resto de la clase.

1. La ampicilina es un derivado del antibiótico penicilina. Interrumpe la formación de la pared celular en las células bacterianas, lo que destruye las células. Sin embargo, nuestro plásmido recombinante contiene un gen que proporciona resistencia a antibióticos al producir una proteína que descompone la ampicilina. ¿Por qué incluimos ampicilina en el medio de prueba?
2. ¿Qué pasará si las células transformadas no crecen en presencia del inductor químico?
3. En el experimento, agregarás los grupos control y experimental de células en diferentes combinaciones de medios. ¿Qué predices para cada condición? Rellena el Cuadro 1 indicando si predices crecimiento o no crecimiento, y si crecimiento, habrá crecimiento mínimo o mucho crecimiento.

Lea los procedimientos a continuación y describa los pasos, usando palabras y un diagrama de flujo en su cuaderno de laboratorio.

Cuadro 1. Predicciones para su experimento; transformación de E. coli

Mediano	Sin control plasmídico	Tratamiento con plásmido
Agar Nutriente
Agar Nutriente + Ampicilina
Agar Nutriente + Ampicilina + Inductor

E. coli transformante

MATERIALES

Reactivos

• Plasmido — en tubo de microcentrífuga
• Caldo Nutriente (NB) — en tubo de microcentrífuga
• Células competentes de E. coli (CC) — en tubo de microcentrífuga (Mantener siempre el tubo CC en hielo)
• 3 placas de agar:

Placa 1: NA

Placa 2: NA/Amp

Placa 3: NA/AMP/IND

Suministros y Equipo

• Micropipeta P-20
• Micropipeta P-200
• Caja de puntas de pipeta (para P-20, P-200)
• Rack para tubos para microfugas
• Dos tubos de microcentrífuga de 1.5 mL
• Marcador permanente
• Guantes Desechables
• Hielo picado en una taza de espuma de poliestireno (primero llene la taza con hielo antes de tomar el tubo CC).
• Paquete de esparcidores de celdas (no retire los esparcidores del paquete hasta que se lo indique)
• Temporizador o reloj
• Rack flotante para tubos para microfugas
• Baño de agua a 42°C
• Incubadora a 37°C
• Cinta
• Contenedor de residuos
• Bolsa de riesgo biológico (para suministros que manejan células)

SEGURIDAD

Verifique su protocolo y siga todas las medidas de seguridad y use el atuendo adecuado antes de realizar el experimento.

Practica la técnica aséptica usando E. coli u otros especímenes vivos en un entorno de laboratorio. La técnica aséptica es la práctica de tomar precauciones para limitar la contaminación potencial tanto a la persona que realiza el experimento como a la muestra/s.

• Use guantes cuando trabaje con bacterias.
• Evite tocar áreas contaminadas, lo que incluye cualquier cosa que haya tocado bacterias. Notifique a su instructor lo antes posible si ocurre un accidente, como un derrame.
• Coloque todos los suministros que hayan estado expuestos a bacterias en una bolsa de riesgo biológico o en un contenedor de desechos biológicos designado. Estos suministros contaminados pueden incluir puntas de pipeta, esparcidores de células y tubos de microcentrífuga.
• Mantener las placas de agar cerradas en todo momento después de sacarlas de la incubadora.
• Siempre lávese las manos durante 20 segundos con agua y jabón antes de salir del laboratorio.

PROCEDIMIENTO

1. Asegúrese de tener todos los reactivos en una rejilla de tubos.
2. Recupera un tubo CC enfriado y mételo en la taza de hielo picado. Mantener las células competentes frías en todo momento. Sostenga el tubo por la llanta, no por la parte inferior.
3. Etiquete la parte superior y los lados de dos nuevos tubos de microcentrífuga con “P-” y “P+”.

Figura 3. Tubos de microcentrífuga etiquetados

4. Ponga los tubos P— y P+ con el tubo CC en hielo.
   Para asegurar los mejores resultados posibles, es crucial que cada paso se siga exactamente. Limite cualquier posible contaminación a los materiales, a usted mismo y a sus alrededores.
5. Agregar células competentes de E. coli (tubo CC) a ambos tubos P y P+.
6. Toma la pipeta P-200, ajusta a 50 µL y ponte una punta.
7. Sujeta el tubo CC por el borde, resuspenda suavemente las celdas bombeando lentamente entre la primera y sin tope con la pipeta (un movimiento suave hacia abajo del émbolo hasta el primer punto de resistencia y luego un movimiento suave hacia arriba hasta la posición superior del émbolo).
8. Agregue 50 µL de células al tubo P+ y coloque el tubo P+ en hielo inmediatamente. Deseche la punta en el contenedor de objetos punzantes.
9. Agarra una nueva punta de pipeta. Repita para el tubo P-. Deseche la punta. Tanto los tubos P- como los P+ deben estar en hielo y contener 50 µL de células competentes.
10. Añadir plásmido al tubo P+ solamente.
    1. Toma la pipeta P-20, ajusta a 10 µL y ponte una punta.
    2. Retirar 10 µL del plásmido y agregarlo al tubo P+. Mezclar juntos bombeando lentamente entre la primera y sin parar 2-3 veces luego vuelva a colocar el tubo sobre hielo.
11. Ponga los tubos P- y P+ en hielo por 15 minutos.
12. Mientras los tubos se están enfriando, obtenga sus placas de agar y marcador. No abra las placas durante este paso
    1. Cada placa de agar contiene diferentes medios: uno de Agar Nutriente solamente (NA), uno de Agar Nutriente + ampicilina (NA/AMP) y uno de Agar Nutriente + inductor de ampicilina + (NA/AMP/IND). Estos pueden estar etiquetados con un patrón de rayas o escritos en la placa
    2. No abra las placas. Dé la vuelta a cada plato; el agar debe estar arriba. Marcar el lado del agar con 1) fecha 2) grupo número 3) periodo de clase. Intenta escribir pequeño a lo largo del borde inferior de la placa.
    3. A continuación, dibuje una línea por la mitad de las placas NA y NA/AMP. Una mitad está etiquetada como “P-” y la otra es “P+”. El NA/AMP/IND solo está etiquetado como “P+”. Deberían verse similares a la Fig 4

Figura 4, Placas etiquetadas

13. Después de que los tubos P- y P+ hayan estado en hielo durante 15 minutos, manténgalos en hielo y lleve la copa de hielo al baño de agua a 42°C. También necesitarás tu temporizador/reloj. Coloque ambos tubos en una rejilla flotante para tubos de microcentrífuga, luego colóquelos en el baño de agua por exactamente 45 segundos.
14. Tan pronto como pasen los 45 segundos, inmediatamente vuelva a colocar los tubos en la copa de hielo y manténgalo en hielo durante un mínimo de 1 minuto.
15. Agrega Caldo Nutriente (NB) a los tubos P- y P+.
    1. Toma la pipeta P-200, ajusta a 150 µL y ponte una punta.
    2. Retire 150 µL de NB y agregue al tubo P-. Mezclar juntos bombeando lentamente entre la primera y sin parar con la pipeta. Deseche la punta en el contenedor de biorresiduos.
    3. Consigue una nueva punta de pipeta. Repita el mismo proceso para el tubo P+.
16. Mantener los tubos a temperatura ambiente durante 15 minutos. Si se está quedando corto en el tiempo, este paso se puede acortar.
17. Agregue células del tubo P— a sus placas de NA y Na/AMP. Mantenga las placas con el lado derecho hacia arriba para que el agar quede en la parte inferior. Se agregan células a la superficie del agar (no a la tapa de plástico).
    1. Toma la pipeta P-200, ajusta a 50 µL y ponte una punta
    2. Toma el tubo P-. Bombee lentamente la pipeta entre la primera y sin parar con la pipeta para resuspender las celdas. Retirar 50 µL de las células.
    3. Levante la tapa de la placa NA como una “concha” para dejar un espacio lo suficientemente grande como para entregar las celdas, al tiempo que disminuye el riesgo de contaminación en el aire. Agregar los 50 µL de células a la mitad P- de la placa. Cierre la placa y prepárese para extender las células.
    4. Repita esto para la placa NA/AMP resuspendiendo las celdas del tubo P con la pipeta y la misma punta. Agregar 50 µL de las células al lado P de la placa NA/AMP usando nuevamente el método de clamshell. Deseche la punta en el contenedor de objetos punzantes.

Figura 5. Cómo distribuir el tratamiento de control sin plásmido en los medios

18. Extienda las células del tubo P— en sus placas de NA y NA/AMP. Debes extender tus platos en este orden.
    1. Abra el paquete esparcidor celular esterilizado. Saque un solo esparcidor y sosténgalo solo por el extremo por el que lo quitó. Tenga cuidado de no tocar el otro extremo del esparcidor a nada más que las células y el agar. Cierre el paquete.
    2. Usando el método “clamshell”, abra la tapa NA y extienda las celdas sobre la mitad P de la placa. Sujeta suavemente el esparcidor plano contra la superficie del agar; trátalo suavemente como si estuvieras manejando gelatina. Cierre la placa.
    3. Repita la misma técnica para la placa NA/AMP en el lado P usando el mismo esparcidor. Una vez que haya terminado, deseche el esparcidor en el contenedor de residuos biológicos designado.
19. Agregue células del tubo P+ a sus placas de NA, Na/AMP y NA/AMP/IND:
    1. Toma la pipeta P-200, comprueba que esté ajustada a 50 µL y ponte una punta.
    2. Toma el tubo P+. Bombee lentamente la pipeta entre la primera y sin parar con la pipeta para resuspender las celdas. Retirar 50 µL de las células.
    3. Abra la placa NA nuevamente como una concha para entregar 50 µL de células a la mitad P+ de la placa. Cierre la placa.
    4. Repita esto para la placa NA/AMP resuspendiendo las celdas con la pipeta y la misma punta. Agregar 50 µL de células a la mitad P+ de la placa. Cierre la placa.
    5. Repita esto para la placa NA/AMP/IND resuspendiendo las celdas con la pipeta y la misma punta. Agregar 50 µL de células dos veces a toda la placa. Hay un total de 100 µL de células P+ agregadas a la placa y deben cubrir toda la superficie cuando se esparcen. Cierre la placa.

Figura 6: Cómo distribuir el tratamiento plasmídico sobre medios.

20. Extienda las células P+ en las placas NA, NA/AMP y NA/AMP/IND. Debes extender tus platos en este orden.
    1. Abra nuevamente el paquete del esparcidor de celdas y saque un solo esparcidor, solo tocando el mango. Hacer Tenga cuidado de no tocar el otro extremo del esparcidor a nada más que las células y agar.
    2. Usando el método de clamshell, abra la tapa NA y extienda las celdas sobre la mitad P+ de la placa. Sujeta suavemente el esparcidor plano contra la superficie del agar; trátalo suavemente como si estuvieras manejando gelatina. Cierre la placa.
    3. Usando el mismo esparcidor, repita la misma técnica para la placa NA/AMP en el lado P+.
    4. Repita la misma técnica para la placa NA/AMP/IND excepto que las celdas deben estar esparcidas por toda la placa, no solo la mitad. Gire la placa suavemente para dispersar uniformemente las celdas con el esparcidor. Una vez que haya terminado, deseche el esparcidor en el contenedor de residuos biológicos designado.
21. Mantenga todas las placas con el lado derecho hacia arriba durante 5 minutos hasta que el líquido se absorba completamente en la placa. Apila las placas juntas y pégalas, etiquetando la cinta con tu periodo de clase, número de grupo y fecha.
22. Coloque las placas boca abajo (lado del agar en la parte superior) en la incubadora a 37°C para evitar que se forme condensación y caiga sobre las células.
23. Ponga cualquier cosa que tocara las células en la bolsa de riesgo biológico, incluyendo puntas de pipeta, tubos de microfuga y esparcidores de células. Limpie las mesas con desinfectantes y lávese las manos.
24. Incubar las placas a 37°C durante 24-36 horas y buscar crecimiento. Mantenga las placas cerradas.
25. Ponga las placas de agar en la bolsa de riesgo biológico cuando se le diga que lo haga.

Figura 7. Extendiendo la E. coli sobre la superficie del medio

Figura 8. E. coli transformada con un plásmido que contiene un gen que codifica una proteína fluorescente que crece en NA+AMP+IND

Análisis

1. Mira los resultados de tu transformación. Llene el Cuadro 2 con observaciones sobre si ve crecimiento o no en los diferentes medios.
2. ¿Sus resultados reales coinciden con los resultados previstos? Si no, ¿qué diferencias ve y cuáles son algunas explicaciones para estas diferencias?
3. ¿Cuántas colonias de colores estaban presentes en su placa NA/AMP/IND?

Figura 9. E. coli transformadas que producen moléculas coloreadas en NA+AMP+IND

Cuadro 2. Transformación de E. coli

Mediano	Sin control plasmídico	Tratamiento con plásmido
Agar Nutriente
Agar Nutriente + Ampicilina
Agar Nutriente + Ampicilina + Inductor

Preguntas de Estudio

1. ¿Por qué se formarían colonias coloreadas en la placa NA/AMP/IND y no en la placa NA/AMP?
2. ¿Cuáles son algunas posibles razones para que se formen colonias coloreadas en la placa NA/AMP?
3. El ADN extracromosómico en bacterias, como un plásmido recombinante, puede replicarse dentro de la célula sin que el resto del ADN de la célula se replique. Esto puede conducir a múltiples plásmidos dentro de una célula. ¿Por qué es importante esto?
4. Anteriormente, aprendiste sobre las interacciones entre ADN, ARN, proteínas y rasgos. Explicar cómo un gen insertado como uno en el ADN plasmídico, se expresa como un rasgo.
5. ¿Cómo pueden las bacterias producir proteínas a partir de ADN extraño, como la insulina humana o una proteína de una medusa como la proteína verde fluorescente (GFP)?
6. ¿Qué pasaría si cultiváramos las bacterias transformadas en presencia de un antibiótico diferente como la kanamicina, en lugar de ampicilina?