1.14: Cromatografía en Columna

Objetivos de aprendizaje

Objetivos:

• Explicar las condiciones para el crecimiento bacteriano y relacionarlo con el objetivo de recolectar proteína.
• Explique qué se entiende por plegamiento de proteínas.
• Describir la relación entre la conformación de una proteína (forma tridimensional) y la función de la proteína.
• Utilice la cromatografía en columna para separar las proteínas.

Resultados de aprendizaje de los estudiantes:

Al finalizar este laboratorio, los estudiantes serán capaces de:

• Lisar las células bacterianas para liberar proteínas.
• Purificar GFP mediante columna de interacción hidrofóbica.
• Identificar la ubicación de GFP a lo largo del proceso de purificación.

Introducción

Las proteínas son moléculas biológicas hechas de cadenas de aminoácidos que adquieren una forma tridimensional llamada conformación. Una conformación específica se logra plegando la cadena de aminoácidos de manera que la proteína pueda realizar un trabajo o función específica para la célula. Si la proteína no se pliega de la manera específica, no puede hacer el trabajo que de otra manera haría. Las proteínas pueden ser purificadas y utilizadas como agentes terapéuticos (fármacos) para tratar a pacientes con afecciones específicas. Debido a que purificar proteínas humanas específicas puede ser difícil o imposible a partir de tejidos humanos o animales, podemos emplear células como bacterias como E. coli para hacer el trabajo. Estas células están diseñadas genéticamente para elaborar las proteínas de interés en grandes cantidades que se purifican más fácilmente.

Un ejemplo de una proteína terapéutica es la insulina, utilizada para tratar la diabetes. Esta fue la primera proteína genéticamente modificada que se introdujo como agente terapéutico. El gen para la insulina humana fue diseñado en un plásmido y este plásmido recombinante se introdujo en E. coli. Las células bacterianas elaboraron insulina la cual fue purificada para ser utilizada en el tratamiento de la diabetes.

De manera similar, la proteína fluorescente verde (gfp) puede ser producida y purificada. Antes de este laboratorio, el gen gfp fue introducido por el proceso de ingeniería genética en un plásmido recombinante capaz de permitir que E. coli produjera proteína a partir de las instrucciones genéticas. La producción de proteína a partir de un gen se denomina expresión. Este plásmido recombinante se introdujo en E. coli mediante el proceso de transformación. Este laboratorio utiliza el proceso de obtención de proteína fluorescente verde purificada para modelar cómo se purifican las proteínas terapéuticas para tratamientos humanos.

Se le proporcionará un cultivo de bacterias que han sido cultivadas e inducidas (estimuladas) para producir gfp. Tratarás las bacterias con una solución que lisará (romperá) las células para liberar la proteína. Entonces empleará el proceso de cromatografía en columna, el foco de este laboratorio. La cromatografía en columna es un método para permitir que una solución fluya sobre una sustancia que se unirá y separará selectivamente los componentes de la solución. En este caso, pequeñas perlas se empaquetan en una columna en forma de tubo y la solución obtenida a través de lisis bacteriana se deja fluir sobre las perlas. A medida que pase otras soluciones sobre la columna, podrá recolectar parte de la solución que fluye a través de las perlas que contendrán un gfp mucho más concentrado y puro.

Células bacterianas en crecimiento

Se entiende bien el patrón de crecimiento de las células bacterianas. En el entorno de laboratorio, el objetivo es cultivar células y hacer que produzcan la proteína que nos interesa purificar. Cuando se utilizan condiciones óptimas para cultivar E. coli, se producirán cuatro fases de crecimiento (ver Figura 1)

Figura 1. Curva de crecimiento bacteriano que describe el cambio en el crecimiento con el

1. Durante la fase de retraso no se produce división celular. Las células se están preparando para dividirse haciendo nuevas enzimas y proteínas, así como copias de su ADN. Las células se agrandan.
2. En la fase logarítmica se está produciendo una duplicación de la población. Esto se denomina crecimiento logarítmico. Las células se someten a fisión binaria (las células se dividen por la mitad) aproximadamente cada 20 minutos para E. coli en condiciones óptimas. Otros tipos de bacterias, y E. coli en condiciones menos que ideales, se dividirán a diferentes velocidades.
3. La fase estacionaria ocurre después de la fase logarítmica cuando no hay cambio general en el tamaño de la población. Durante este periodo, la división celular equivale a la muerte celular y ocurre a medida que se agotan recursos como los nutrientes y el oxígeno, y los productos de desecho se están acumulando en el ambiente.
4. Durante la fase de declive o muerte de un cultivo bacteriano, las células mueren más rápido de lo que se replican. La población celular está disminuyendo. Esto ocurre a medida que los desechos se construyen más y se agota el suministro de alimentos.

CONSIDERAR: Si el gen de interés está controlado por un operón, como el operón lac, ¿cuándo es el mejor momento para activar el gen? Tenga en cuenta:

• La producción de la proteína quita energía a los procesos de crecimiento celular y división celular.
• Un mayor número de células producirá más proteína
• Las proteínas pueden degradarse con el tiempo

Actividad previa al laboratorio: Think Pair Compartir - Discuta lo que ya sabe

Antes del periodo de laboratorio deberías leer el material, tomar algunas notas sobre tus pensamientos sobre las siguientes preguntas (Piense). En laboratorio, se le pedirá que discuta con su pareja sus pensamientos y escuche los suyos (Par). Tome notas adicionales sobre nuevas ideas durante esta pequeña discusión. Por último, es posible que se te pida que discutas tus ideas con la clase (Comparte). No se espera que conozcas todas las respuestas antes de la discusión en clase pero al final de la actividad, deberías tener las preguntas respondidas completa y correctamente.

1. ¿Cuál es el término para la reproducción bacteriana? Describir este proceso.
2. ¿Qué papel desempeñan las proteínas dentro de las células?
3. ¿Qué sucede con la función proteica si una proteína pierde, o nunca logra correctamente, la conformación prescrita?
4. ¿Cómo se relaciona el orden de los aminoácidos con la conformación de las proteínas y, por lo tanto, la función de
5. Ya que podemos controlar cuándo “encender” o expresar nuestro gen, ¿cuándo es el mejor momento para hacerlo? Para ayudarte a decidir pregúntate:
   1. ¿La producción de proteína tomaría energía?
   2. ¿Un mayor número de células produciría más de tu proteína de interés que menos células?
   3. ¿Se pueden degradar las proteínas si se dejan demasiado tiempo?
6. Compare sus diagramas de flujo entre sí antes de comenzar el laboratorio. Anote cualquier diferencia e intente resolver qué diagrama (s) de flujo tiene (n) información más precisa. Ajusta tu propio diagrama de flujo según sea necesario.

Purificación de Proteína

Las bacterias transformadas pueden multiplicarse en cultivo y producir la proteína de interés. Si esta proteína va a ser utilizada terapéuticamente, necesitará ser purificada. Esto significa que otros componentes celulares, incluyendo otras proteínas, deben estar separados de tu proteína. La cromatografía en columna es un método común para separar proteínas.

Las proteínas están hechas de aminoácidos. Los aminoácidos individuales tienen diferentes propiedades como hidrofobicidad (que odia el agua) o hidrofilicidad (gusto por el agua), carga iónica o la capacidad de formar enlaces débiles o fuertes con otros aminoácidos. Cuando una proteína se elabora por primera vez en una célula, es una cadena larga de aminoácidos en un orden determinado por el gen. El orden de los aminoácidos en una proteína determina cómo se plegará la cadena para producir una conformación proteica tridimensional (Ver Figura 2). Esta conformación específica tendrá diferentes aminoácidos interactuando entre sí de maneras específicas. Los aminoácidos que se enfrentan al ambiente en una proteína plegada pueden interactuar con otras moléculas. Grupos específicos de aminoácidos cercanos entre sí pueden formar sitios de unión para interactuar con otras moléculas específicas. En general, estas relaciones determinan la estructura proteica y, por lo tanto, la función Imagínese proteínas involucradas en reacciones enzimáticas, como canales en membranas, en el transporte de otras moléculas, o para unir ADN. Todas estas proteínas tienen interacciones de unión muy específicas determinadas por aminoácidos en localizaciones específicas en una proteína plegada.

Figura 2. El plegamiento de una proteína

PREGUNTA: Si los aminoácidos individuales se intercambian o eliminan en una cadena de aminoácidos, ¿imaginas que esto afectaría la función de una proteína?

Las reglas para el plegamiento proteico no se entienden perfectamente y es un área de investigación científica activa. No obstante, se han descubierto algunas reglas básicas. Los factores que hacen que las proteínas se plieguen de maneras específicas incluyen:

1. Se formarán enlaces débiles entre los aminoácidos con una carga negativa y una positiva.
2. Se formarán enlaces fuertes (covalentes) entre los aminoácidos que contienen azufre. Estos se llaman puentes disulfuro.
3. Los aminoácidos hidrofílicos se localizan en las superficies externas de las proteínas porque interactúan con el ambiente celular, que es principalmente agua. Los aminoácidos hidrofóbicos se esconden en el interior de las proteínas o se incrustan dentro de las membranas celulares para evitar el contacto con el agua en el ambiente.

Figura 3. Cromatografía en columna líquida

Dependiendo del contenido de aminoácidos en una proteína específica, en general adquirirá un carácter hidrofóbico o hidrofílico. La cromatografía en columna puede separar proteínas hidrofílicas e hidrofóbicas del resto del contenido celular. Pequeñas perlas recubiertas con un material llamado resina se empaquetan en una columna. La resina atrae proteínas que se unirán a la resina a medida que otros contenidos celulares fluyen más allá. Para que las proteínas hidrófobas se adhieran, deben tratarse para exponer los aminoácidos hidrófobos típicamente enterrados. Las soluciones tampón se pueden usar para hacer que las proteínas se desnaturalicen (desplieguen) y expongan los aminoácidos que serán atraídos por la resina.

Diferentes tampones se pasan sobre la columna en un orden determinado para separar mejor las proteínas de interés del resto del contenido celular. La Figura 14.4 muestra tres soluciones utilizadas para separar la proteína fluorescente verde del resto de la célula. El tampón de unión desnaturaliza las proteínas para que los aminoácidos hidrófobos se adhieran a la resina. El tampón de lavado elimina las proteínas y el material débilmente adherentes de la columna dejando la proteína de interés más fuertemente unida. Finalmente, el tampón de elución, que tiene una baja concentración de tampón, hace que la proteína comience a replegarse para ocultar los aminoácidos hidrófobos que liberan la proteína de las perlas recubiertas de resina en la columna. La porción o fracción de líquido que sale de la columna que contiene tu proteína se puede capturar en un recipiente y guardar.

Figura 4. Separación de proteína fluorescente verde por hidrofobicidad mediante cromatografía en columna

PREGUNTA: ¿Cree que todos los tipos de proteínas usarían los mismos tipos de perlas recubiertas de resina y los mismos tipos de tampones para purificarse? Explica tu respuesta.

Parte I: Lisis de Células Bacterianas

Previamente, las bacterias se transformaron con un plásmido recombinante capaz de expresar gfp cuando se indujeron las células. La razón por la que las células pueden ser inducidas para producir proteína es que dentro del plásmido, frente al gen para gfp, hay una secuencia especial de ADN que responderá si se coloca un químico en el medio. Este químico se llama inductor (ind) y señala que el gen debe estar “encendido” y el ARN mensajero debe transcribirse a partir de las instrucciones de ADN y se debe producir la proteína. El plásmido también contiene el gen seleccionable de resistencia a ampicilina (amp) para asegurar que las células que crecen en su cultivo sean células que contienen su plásmido.

Antes de este periodo de laboratorio, las células se cultivaron en presencia de ampicilina hasta finales de la fase logarítmica. Las células en cultivo se dividen y cada célula contiene muchas copias del plásmido. En la fase logarítmica tardía, se agregó el inductor químico al medio para activar el gen gfp y se permitió que las células continuaran creciendo y produciendo gfp.

Primero, recogerás tus celdas y las abrirás. Este proceso se llama lisis celular. Después de lisar las células, utilizará cromatografía en columna para purificar gfp.

MATERIALES

Reactivos

• Rack para tubos para microfugas con los siguientes tubos:
  • Cultivo LB/AMP/Ind de células de E. coli (EC)
  • Amortiguador de elución (EB)
  • Buffer de lisis (LyB)
• 1mL extra de la cultura EC — del instructor

Equipo y Suministros

• Micropipeta P-200
• Caja de puntas de pipeta
• Marcador permanente
• Microcentrífuga (compartida con clase)
• Mezclador Vortex (compartido con clase)
• Luz UV de onda larga
• Contenedor de residuos líquidos
• Contenedor para objetos punzantes
• Bolsa de riesgo biológico para materiales que entran en contacto con células de E. coli (compartida con clase)

Recordatorios de Seguridad

Se deben tomar las precauciones de seguridad adecuadas en todo momento. Estos serán revisados por su instructor y se pueden encontrar en el inicio de su manual de laboratorio al que debe consultar antes de comenzar este procedimiento. Se requiere técnica aséptica al manipular E.coli y materiales que hayan entrado en contacto con el cultivo bacteriano. Recuerda que la técnica aséptica son los procedimientos utilizados para proteger tu cultivo y muestras de la contaminación pero también protegerte.

1. Desinfecta tu área de trabajo y lávate las manos antes de comenzar un experimento.
2. Nunca toque nada que haya entrado en contacto con la E.coli. Esto incluye pipetas, esparcidores y el interior de los tubos. Las puntas de pipeta nunca deben tocar nada excepto el material a transferir. Los esparcidores y pipetas solo deben manejarse desde el extremo que no toquen las bacterias.
3. Al manipular las placas de Petri, solo abra la tapa lo suficiente para trabajar con la superficie del agar y luego cerrar la tapa inmediatamente. Esto evitará la contaminación, como esporas de hongos del aire, aterrizando en tu placa de agar.
4. Si algo se contamina accidentalmente, hable con su instructor para preguntar si un reemplazo es apropiado y disponible.
5. Evita derrames. Si ocurre uno, notifique a su instructor de inmediato para que le ayude a limpiarlo adecuadamente.
6. Los desechos contaminados, como los tubos de microfuga usados y los esparcidores de células, se colocarán en la bolsa de riesgo biológico. Las puntas de pipeta se colocarán en un recipiente para objetos punzantes.
7. Solo cuando se le indique que lo haga, desechará sus placas de Petri usadas en los desechos biopeligrosos.
8. Asegúrese de limpiar su área de trabajo y lavarse las manos antes de salir del laboratorio.

Trámites

1. Tome una luz UV de onda larga y mire el tubo EC, registre sus observaciones.
2. Pesar su tubo EC. Busque otro tubo con un peso similar; +/- 0.1g o cree un tubo de equilibrio para la microcentrífuga.
3. Girar el tubo EC durante 5 minutos a 13,000 rpm (o la velocidad más alta posible) en una microcentrífuga. Asegúrese de equilibrar los tubos correctamente.
4. Saca con mucho cuidado el tubo EC de la microcentrífuga. Evite perturbar el sedimento celular en la parte inferior del tubo.
5. Toma la micropipeta P-200, ponla en 200.0 µL y consigue una propina. Presione hasta la primera parada antes de entrar en el sobrenadante (capa líquida) y extraiga suavemente el medio de crecimiento líquido viejo. No perturbe el pellet celular al hacerlo.
6. Deseche el líquido en el contenedor de desechos líquidos y la punta en el recipiente para objetos punzantes.
7. Lleve su pellet celular (el tubo EC) a su instructor para dispensar 1 ml del mismo cultivo en su tubo.
8. Repita los pasos 2-6, así que centrifugue las células por 5 min nuevamente y retire el sobrenadante. Registrar el color del sobrenadante y el sedimento en esta etapa.
9. Toma la micropipeta P-200 y una punta nueva e intenta con cuidado eliminar completamente todo el líquido del pellet sin tomar las células. Deseche la punta en objetos punzantes.
10. Establezca el P-200 en 150.0 µL y obtenga una nueva propina. Agregar 150 µL de tampón de elución (EB) al tubo EC. Deseche la punta.
11. Cierre firmemente el tubo EC y vuelva a suspender el sedimento celular con un vortexer. Si uno no está disponible, arrastre el tubo rápidamente a través de una rejilla de tubos de microcentrífuga vacía. Esto debería hacer que el sedimento celular se desaloje del fondo del tubo y el tampón se vuelva turbio. Repita este movimiento hasta que todo el pellet se haya ido.
12. Toma el P-200 y consigue una nueva propina. Agregar 150 µL de tampón de lisis (LyB) al tubo EC. Mezcle el contenido del tubo con un vortexer o el método de rack de tubos de microcentrífuga como anteriormente.
13. El tubo EC se incubará en el tampón de lisis durante la noche a temperatura ambiente. Etiqueta tu tubo con periodo de clase y número de grupo y dáselo a tu instructor para que haga este paso.
14. Limpie su área de trabajo y deseche todos los tubos y puntas contaminados en los desechos biopeligrosos apropiados.

Parte II: Uso de cromatografía en columna para separar la proteína verde fluorescente

Materiales

Reactivos

• Rack de tubos de microcentrífuga con el tubo EC que contiene células, tampón de elución y tampón de lisis
• Botellas de:
• Buffer de unión (BB) = 4,0 M Solución de sulfato de amonio
• Buffer de equilibrado (EQ) = solución de sulfato amónico 2.0 M
• Buffer de lavado (WB) = solución 1.3 M de sulfato de amonio
• Solución tampón de elución (EB) = Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0
• Solución de etanol al 20% (Para limpiar y almacenar resina en columnas al final del laboratorio)

Equipo y Suministros

• Micropipeta P-1000
• Caja de puntas de pipeta
• Tubos de microcentrífuga de 2-3, 1.5 mL
• Columna de cromatografía
• Microcentrífuga (compartida)
• Contenedor de residuos líquidos
• Contenedor de residuos biopeligrosos
• Contenedor para objetos punzantes

Procedimiento

1. Divida el trabajo asignando a una persona que haga el paso 2-3, otra 4-5, y una tercera haga 6-7.
2. Verifica que cuentes con todos los materiales necesarios.
3. Etiquete un tubo de microcentrífuga como “SUPER” y otro como “GFP”.
4. Configura tu columna según las indicaciones, manténgalas siempre en posición vertical. Nunca permita que la resina de la columna se seque completamente.
5. Para configurar la columna:

• Quita las tapas en la parte superior e inferior de la columna. No confunda la tapa inferior con la válvula de paso.
• Colocar el contenedor de residuos líquidos de la columna en la base de la columna.
• Gire la válvula de paso a una posición vertical y drene la columna hasta que queden 1-2 mm de líquido por encima de la resina de la columna. Gire la llave de paso a una posición horizontal para cerrar la válvula.
• Tome la micropipeta P-1000, coloque una punta y ajuste a 1000 µL. Agregar 1000 µL de tampón de equilibrado (EQ) suavemente por el costado de la columna, tratando de perturbar el lecho de resina lo menos posible.
• Drene la columna hasta que queden 1-2 mm de líquido por encima de la resina de la columna y luego cierre la válvula.
• Usando la misma punta, agregue otros 1000 µL de tampón de equilibrado (EQ) suavemente por el costado de la columna, tratando de perturbar el lecho de resina lo menos posible. Deseche la punta después.
• Drene la columna hasta que queden 1-2 mm de líquido por encima de la resina de la columna y luego cierre la válvula.
• Verifique que el líquido dejó de drenar cuando la válvula está cerrada.

6. Pesar el tubo EC, encontrar un tubo de equilibrio y girar el tubo hacia abajo durante 5 min a 13,000 rpm (o la velocidad más alta) en una microcentrífuga. Asegúrese de equilibrar la microcentrífuga.
7. Retire con cuidado el tubo y tráelo de vuelta a su espacio de trabajo. Registre sus observaciones cuando use una luz UV de onda larga para examinar el tubo. ¿Qué observa con respecto al pellet y el sobrenadante?
8. Toma la micropipeta P-1000, establece en 250 µL y consigue una punta. Con mucho cuidado, trate de eliminar la mayor parte del sobrenadante y transfiéralo al tubo etiquetado “SUPER”. Si el pellet se altera durante este paso, gire nuevamente el tubo y repita este paso. Deseche la punta vacía en objetos punzantes.
9. Obtenga una nueva punta y agregue 250 µL de tampón de unión (BB) al tubo SUPER. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo dos veces para mezclar la solución. Ahora debería haber aproximadamente 500 µL de líquido total.
10. Con la misma punta, agregue 200 µL de la solución de tubo SUPER a la columna dos veces. Todo el contenido del tubo SUPER debe agregarse a la columna. Gotee lentamente la solución por los lados de la columna, de modo que el lecho de resina se perturbe lo menos posible. Deseche la punta en objetos punzantes.
11. Gire la válvula de paso y drene el líquido de la columna hasta que haya 1-2 mm de líquido por encima de la resina.
12. Utilice la luz UV de onda larga para examinar la columna y registrar sus resultados. ¿Dónde se encuentra la proteína verde fluorescente en este paso?
13. Toma la micropipeta P-1000 y ponla en 1000 µL y consigue una nueva punta. Agregar 1000 µL de tampón de lavado (WB) suavemente por el costado de la columna, nuevamente tratando de perturbar el lecho de resina lo menos posible. Deseche la punta en objetos punzantes.
14. Escurrir el tampón de lavado hasta que haya 1-2 mm de líquido por encima de la resina.
15. Utilice la luz UV de onda larga para examinar la columna y registrar sus resultados. ¿Dónde se encuentra la proteína verde fluorescente en este paso?
16. Con una nueva punta para la pipeta P-1000, agregar 1000 µL de tampón de elución dos veces a la columna (un total de 2 mL de tampón de elución). Lentamente agrega el búfer por los lados de la columna. Deseche la punta en objetos punzantes.
17. Sostenga su tubo “GFP” debajo de la válvula de paso de la columna. Otra persona debe brillar la luz UV en la columna para que pueda localizarse GFP. Abra la válvula de paso y recoja la GFP en el tubo GFP. OPCIONAL: Para este paso, si tienes un tubo de microcentrífuga extra, puedes recolectar el líquido fluorescente más débil en uno y el resplandor más fuerte en otro para concentrar la GFP.
18. Una vez que la GFP se haya recolectado mayoritariamente, drene la columna en el contenedor de desechos hasta que 1-2 mm de líquido estén por encima de la resina.
19. Con una nueva punta, agregue 1000 µL de solución de almacenamiento- 20% de etanol tres veces al costado de la columna.
20. Escurrir la columna hasta que haya 1 cm de líquido por encima del lecho de resina.
21. Vuelva a colocar las tapas en la parte superior e inferior de la columna para guardarlas.
22. Deseche el flujo de la columna a través del contenedor de desechos vertiendo el contenido por el desagüe en el fregadero.

Análisis de datos

Mientras esté bajo la luz UV, compare su tubo GFP con los tubos GFP de otros grupos. Registre las diferencias observadas en la intensidad del color en su libro de laboratorio.

Preguntas de Estudio

1. ¿Qué características de los aminoácidos son importantes para la conformación de las proteínas?
2. ¿Cómo se relaciona la conformación proteica con la función de la proteína?
3. ¿Notaste si tu solución celular lisada se veía más o menos brillante que la fracción que recolectaste de la columna? Si observaste una diferencia, ¿por qué podría ser ese el caso?
4. ¿Por qué puedes usar la columna para separar tu proteína verde fluorescente de los demás componentes celulares?
5. Para este procedimiento, ¿qué se podría ajustar para aumentar la pureza de su proteína en la muestra?