3.2: Visión general de la tecnología de ADN recombinante
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La tecnología de ADN recombinante utiliza el poder de los procedimientos de selección microbiológica y cribado para permitir a los investigadores aislar un gen que representa tan poco como 1 parte en un millón del material genético en un organismo. El ADN del organismo de interés se divide en pequeños trozos que luego se colocan en células individuales (generalmente bacterianas). Estas se pueden separar como colonias individuales en placas, y pueden ser cribadas rápidamente para encontrar el gen de interés. Este proceso se llama clonación molecular.
Unir ADN in vitro para formar moléculas recombinantes
Las endonucleasas de restricción cortan en secuencias definidas de (usualmente) 4 ó 6 pb. Esto permite cortar el ADN de interés en localizaciones específicas. La función fisiológica de las endonucleasas de restricción es servir como parte del sistema para proteger a las bacterias de la invasión por virus u otros organismos. (Ver Capítulo 7)
| Enzima | Sitio | Enzima | Sitio | |
|---|---|---|---|---|
| Alu I | AG'CT | No yo | GC'GGCCGC | |
| Bam HI | G'GATCC | Pst I | CTGCA'G | |
| Bgl II | A'GATCT | PVU II | CAG'CTG | |
| Eco RI | G'AATTC | Sal I | G'TCGAC | |
| Hae III | GG'CC | Sau 3AI | 'GATC | |
| Hha I | GCG'C | Sma I | CCC'GGG | |
| Hin CiI | GTY'RAC | Spe I | A'CTAGT | |
| Hin DiII | A'AGCTT | Taq I | T'CGA | |
| Hin Fi | G'ANTC | Xba I | T'CTAGA | |
| Hpa II | C'CGG | Xho I | C'TCGAG | |
| Kpn I | GGTAC'C | Xma I | C'CCGGG | |
| Mbo I | 'GATC |
N = A, G, C o T
R = A o G
Y = C o T
S = G o C
W = A o T
a. Extremos pegajosos
(1) Dado que las secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restricción son pseudopalíndromes, una escisión descentrada en el sitio de reconocimiento generará un saliente 5' o un saliente 3' con extremos autocomplementarios (o “pegajosos”).
ej., 5' voladizo EcoRI G'AATTC
BamHi G'GATCC
3' VolantePSTI CTGCA'G
2) Cuando los extremos de los fragmentos de restricción sean complementarios,
por ejemplo, para EcoRI 5'‑‑G AATTC‑‑‑3'
3'‑‑CTTAA G‑‑‑5'
los extremos pueden recocerse entre sí. Dos fragmentos cualesquiera, independientemente de su origen (animal, vegetal, fúngico, bacteriano) pueden unirse in vitro para formar moléculas recombinantes (Figura 3.3).
Figura 3.3.
b. extremos romos
(1) La endonucleasa de restricción se escinde en el centro del sitio de reconocimiento pseudopalindrómico para generar extremos romos (o enrasados).
(2) Por ejemplo HaelIII GG'CC
HinciI GTY'RAC
La ADN ligasa T4 se usa para unir fragmentos de ADN (Figura 3.4). Tenga en cuenta que los extremos “pegajosos” hibridados de los fragmentos de restricción tienen mellas (generalmente separadas por 4 pb). Las mellas son roturas en la cadena principal del fosfodiéster, pero todos los nucleótidos están presentes. A los huecos en una cadena les falta una cadena de nucleótidos.
La ADN ligasa T4 utiliza ATP como fuente de grupo adenililo unido al extremo 5' de la mella, que es un buen grupo saliente después del ataque por el OH 3'. (Ver Capítulo 5 sobre Replicación).
A alta concentración de extremos de ADN y de ligasa, la enzima también puede ligar fragmentos de ADN de extremos romos. Por lo tanto, dos fragmentos de extremos romos pueden ligarse entre sí. Nota: Cualquier fragmento con un saliente 5' puede convertirse fácilmente en una molécula de extremos romos mediante síntesis de relleno catalizada por una ADN polimerasa (a menudo el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I). Entonces se puede ligar a otro fragmento de extremos romos.
Los enlazadores son oligonucleótidos dúplex cortos que contienen un sitio de escisión de endonucleasa de restricción. Se pueden ligar a cualquier molécula de extremos romos, generando así un nuevo sitio de escisión por restricción en los extremos de la molécula. La ligación de un enlazador en un fragmento de restricción seguido de escisión con la endonucleasa de restricción es una de varias formas de generar un extremo que es fácil de ligar a otro fragmento de ADN.
El recocido de colas de homopolímero es otra forma de unir dos moléculas de ADN diferentes.
La enzima desoxinucleotidil-transferasa terminal catalizará la adición de una cadena de nucleótidos al extremo 3' de un fragmento de ADN. Así, al incubar cada fragmento de ADN con el dNTP apropiado y la desoxinucleotidil-transferasa terminal, se pueden añadir homopolímeros complementarios a los extremos de los ADN que se desea combinar. Por ejemplo, se puede agregar una cadena de G a los extremos 3' de un fragmento y una cadena de C a los extremos 3' del otro fragmento. Ahora los dos fragmentos se unirán a través de las colas de homopolímero.
