4.7: Análisis Comparativo del Genoma

Genes Paralogos

• Los genes que son similares por el descenso de un ancestro común son homólogos.
• Los genes homólogos que han divergido después de la especiación son ortólogos.
• Los genes homólogos que han divergido después de la duplicación son parálogos.

Se pueden identificar grupos parálogos de genes que codifican proteínas de función similar pero no idéntica en una especie por ejemplo, transportadores ABC: 80 miembros en E. coli

Los proteomas centrales varían poco en tamaño

Proteoma: todas las proteínas codificadas en un genoma

Para calcular el proteoma Core:

Contar cada grupo de proteínas parálogas solo una vez

Número de familias de proteínas distintas en cada organismo

Especies	Número de genes	Proteoma central
Haemophilus	1709	1425
Levadura	6241	4383
Gusano	18424	9453
Vuela	13601	8065

Figura 4.22.Poco cambio en el tamaño del proteoma central en eucariotas

Los proteomas centrales se conservan

• Muchas de las proteínas en los proteomas centrales son compartidas entre eucariotas
• El 30% de los genes de la mosca tienen ortólogos en gusanos
• El 20% de los genes de la mosca tienen ortólogos tanto en gusanos como en levaduras
• El 50% de los genes de la mosca tienen probablemente ortólogos en mamíferos

La función de las proteínas en las moscas (y gusanos y levaduras) proporciona fuertes indicadores de función en humanos. Las moscas tienen ortólogos para 177 de los 289 genes de enfermedades humanas

Figura 4.23. Categorías funcionales en proteomas eucariotas

Figura 4.24. Distribución de los homólogos de las proteínas humanas predichas

Segmentos conservados en los genomas humanos y de ratón

Figura 4.25. Regiones de cromosomas humanos homólogas a regiones de cromosomas de ratón (indicadas por los colores). Por ejemplo, prácticamente todo el cromosoma humano 20 es homólogo a una región en el cromosoma 2 de ratón, y casi todo el cromosoma 17 humano es homólogo a una región en el cromosoma 11 de ratón. Más comúnmente, los segmentos de un determinado cromosomas humanos son homólogos a diferentes cromosomas de ratón. Los crososomas de ratón tienen más reordenamientos en relación con los humanos que los cromosomas de muchos mamíferos, pero las relaciones homólogas aún son evidentes.

CROMOSOMAS Y CROMATINA

Los cromosomas son el paquete citológico para los genes. Los genomas son mucho más largos que el compartimento celular que ocupan dimensiones del compartimento longitud del ADN

• Fago T4:\[0.065 \times 0.10 \,mm 55\, mm = 170\, kb\]
• E. coli:\[1.7 \times 0.65\, mm \,1.3\, mm = 4.6 \times 10^3\, kb\]
• Núcleo (humano):\[6 mm \,diam. 1.8\, m = 6 \times 10^6\, kb\]

Definición: Relación de empaque

\[\text{Packing ratio} = \dfrac{\text{length of DNA}}{\text{length of the unit that contains it}}.\]

El cromosoma humano más pequeño contiene aproximadamente

\[46 \times 10^6\, bp = 14,000\, mm = 1.4\,cm \,DNA.\]

Cuando se condensa para la mitosis, este cromosoma tiene aproximadamente. 2 mm de largo. ¡La relación de empaque es por lo tanto de aproximadamente 7000!

Bucles, matriz y el andamio cromosómico

Cuando el ADN se libera de los cromosomas mitóticos mediante la eliminación de la mayoría de las proteínas, se ven bucles largos de ADN, emanando de un andamio central que se asemeja a los restos del cromosoma.

Figura 4.26: El análisis EM de núcleos intactos muestra una red de fibras llamada matriz.

Preparaciones bioquímicas que utilizan sal y detergente para eliminar proteínas y nucleasa para eliminar la mayor parte del ADN deja una preparación de “matriz” o “andamio”. En estas preparaciones se encuentran secuencias de ADN similares; estas secuencias se denominan regiones de unión a la matriz = MAR (o regiones de unión a andamios = SARs). Suelen ser ricos en A+T y tienen sitios de escisión por topoisomerasa II. La topoisomerasa II es uno de los componentes principales de la preparación de la matriz; pero la composición de la matriz aún necesita un estudio adicional.

Dado que está unido en la base a la matriz, cada bucle es un dominio topológico separado y puede acumular superbobinas de ADN.

A partir de los tamaños medidos de los bucles, y los cálculos basados en la cantidad de mellas requeridas para relajar el ADN dentro de los bucles, estimamos que el tamaño promedio de estos bucles es de aproximadamente 100 kb (85 kb basado en la frecuencia de mellado para relajación).

Algunas evidencias sugieren que la replicación y posiblemente algún control transcripcional pueden ejercerse en las bases de los bucles.

Cromatina interfásica y cromosomas mitóticos

Durante la interfase, es decir, entre divisiones mitóticas, los cromosomas mitóticos altamente condensados se extienden a través del núcleo para formar cromatina. La cromatina interfásica no está muy densamente empaquetada en la mayor parte del núcleo (eucromatina). En algunas regiones está muy densamente empaquetada, comparable a un cromosoma mitótico (heterocromatina).

Tanto la cromatina interfásica como los cromosomas mitóticos están hechos de una fibra de 30 nm. El cromosoma mitótico está mucho más enrollado que los cromosomas interfásicos.

La mayor parte de la transcripción ocurre en la eucarimatina.

• Heterocromatina constitutiva = regiones no expresadas que están condensadas (compactas) en todas las células (por ejemplo, repeticiones simples centroméricas)
• Heterocromatina facultativa = inactiva solo en algunos linajes celulares, activa en otros.

Un ejemplo de heterocromatina es el cromosoma X inactivo en mamíferos hembra. La elección de qué crosomosoma X inactivar es aleatoria en varios linajes celulares, lo que lleva a un mosaico de fenotipos para algunos rasgos ligados a X. Por ejemplo, un determinante genético del color del pelaje en gatos está ligado al X, y la coloración irregular en gatos calicó resulta de esta inactivación aleatoria de uno de los cromosomas X, lo que lleva a la falta de expresión de este determinante en algunas pero no todas las células ciliadas.

Bandas citológicamente visibles en cromosomas

Bandas G y bandas R en cromosomas mitóticos de mamíferos (Figura 4.27)

Las bandas Giemsa‑dark (G) tienden a ser ricas en A+T, con un gran número de repeticiones L1.

Las bandas Giemsa‑light tienden a ser más ricas en G+C, con muy pocas repeticiones L1 y muchas repeticiones Alu.

(Las bandas R son aproximadamente las mismas que las bandas Giemsa-light. Se visualizan mediante un procedimiento preparativo diferente para que se vea el “reverso” de las imágenes teñidas con Giemsa).

Las bandas T son adyacentes a los telómeros, no se tiñen con Giemsa, y son extremadamente ricas en G+C, con muchos genes y miríadas de repeticiones de Alu.

El significado funcional de estas bandas aún está bajo investigación activa.

Se puede localizar un gen en una región particular de un cromosoma mediante hibridación in situ con una sonda radiactiva o, ahora más comúnmente, fluorescente para el gen. La región de hibridación se determina viendo simultáneamente el patrón de bandas teñidas y el patrón de hibridación. Muchos diferenciales de cromosomas mitóticos son vistos y puntuados, y el gen se localiza en la región cromosómica con una incidencia significativamente mayor de señal de hibridación que la observada en el resto de los cromosomas.

Otro método común para mapear la ubicación de los genes es mediante hibridación con ADN aislado de un panel de híbridos de células somáticas, cada célula híbrida portando un pequeño subconjunto de, por ejemplo, cromosomas humanos en un fondo de hámster. Algunas células híbridas portan cromosomas humanos rotos, lo que permite una localización aún más precisa (ver Figura 1.8.2, “serie J-1”).

Los cromosomas de politeno son visibles en varios Drosophilatissues

Estos contienen muchas copias de los cromosomas, lado a lado en registro. Así, la mayoría de las regiones cromosómicas están altamente amplificadas en estos tejidos. Las manchas cromosómicas revelan un patrón característico de bandas, que es la base del mapa citológico. El mapa citológico (de bandas de politeno) combinado con el mapa genético da un mapa citogenético, que es una guía maravillosa para el genoma de Drosophila. Se puede localizar un gen a una región particular mediante hibridación in situ (de hecho, la técnica se inventó usando cromoomas de politeno de Drosophila.

Múltiples genes por banda en cromosomas de mamíferos

La Figura 4.27 da una vista del cromosoma 11 humano a varios niveles diferentes de resolución. La región 11p15 tiene muchos genes de interés, incluyendo genes cuyos productos regulan el crecimiento celular (HRAS), la determinación y diferenciación de las células musculares (MYOD), el metabolismo de carbohidratos (INS) y el metabolismo mineral (PTH). El gen de la b-globina (HBB) y sus parientes estrechamente vinculados también se encuentran en esta región. Se muestra una vista de mayor resolución de 11p15, basada en una compilación de mapeo genético y físico (Cytogenetics and Cell Genetics, 1995) junto al ideograma clásico (patrón de bandas). Esto está en una escala de millones de pares de bases, y uno puede comenzar a tener una idea de la densidad génica en esta región. Curiosamente, varía bastante, con las sub-bandas densas génicas cerca de los telómeros; estas pueden corresponder a las bandas T discutidas anteriormente. Otros genes parecen estar más ampliamente separados. Por ejemplo, cada uno de los genes de globina tipo b está separado por aproximadamente 5 a 8 kb entre sí (ver el mapa del YAC, o cromosoma artificial de levadura, que porta los genes de globina tipo b), y este grupo de genes está a aproximadamente 1000 kb (es decir, 1 Mb) de los genes más cercanos en el mapa. Sin embargo, el mapeo adicional probablemente encontrará muchos otros genes en esta región. Ahora aún más información está disponible en los sitios web mencionados anteriormente.

Figura 4.27.

La relación entre las distancias de recombinación y las distancias físicas varía sustancialmente entre los organismos. En humanos, un Centimorgan (o cM) corresponde aproximadamente a 1 Mb, mientras que en levadura 1 cM corresponde a aproximadamente 2 kb, y este valor varía al menos 10 veces a lo largo de los diferentes cromosomas de levadura. Esto es resultado de las diferentes frecuencias de recombinación a lo largo de los cromosomas.

Regiones especializadas de cromosomas

Centromere: región responsable de la segregación de cromosomas a la mitosis y meiosis. El centrómero es una región constreñida (generalmente) hacia el centro del cromosoma (aunque se puede ubicar al final, como ocurre con los cromosomas de ratón). Contiene un cinetocoro, una región fibrosa a la que se unen los microtúbulos a medida que tiran del cromosoma a un polo de la célula en división. Las secuencias de ADN en esta región son secuencias simples altamente repetidas (en Drosophila, la unidad de la repetición es de aproximadamente 25 pb de longitud, repetida cientos de veces). Las proteínas específicas están en el centrómero, y ahora se investigan intensamente.

Telómero: forma los extremos de la molécula lineal de ADN que conforma el cromosoma. Los telómeros están compuestos por miles de repeticiones de CCCTAA en humanos. Variantes de esta secuencia se encuentran en los telómeros de otras especies. Los telómeros están formados por la telomerasa; esta enzima catalizó la síntesis de más extremos en cada ronda de replicación para estabilizar moléculas lineales.

Las Proteínas Principales en la Cromatina son las Histonas

Composición de la cromatina: Diversos métodos bioquímicos están disponibles para aislar la cromatina de núcleos. El análisis químico de la cromatina revela proteínas y ADN, siendo las proteínas más abundantes las histonas. Un conjunto complejo de histonas menos abundantes se conoce como las proteínas cromosómicas no histonas.

Las histonas y el ADN se presentan en masas iguales.

Proporción de Masa ADN: histonas: proteínas no histonas: ARN = 1:1:1:0.1

Las histonas son proteínas pequeñas, básicas (cargadas positivamente) y altamente conservadas. Se unen entre sí para formar complejos específicos, alrededor de los cuales el ADN se envuelve para formar nucleosomas. Los nucleosomas son la unidad fundamental de repetición de la cromatina.

Hay 5 histonas, 4 en el núcleo del nucleosoma y una fuera del núcleo.

H3, H4: secuencia rica en Arg, más conservada ü

Histonas CORE

H2A, H2B: Ligeramente rica en Lys, bastante conservada

H1: muy rica en Lys, más variable en secuencia entre especies.

Los estudios de difracción de rayos X de los complejos de histonas y el núcleo del nucleosoma han proporcionado información detallada sobre cómo las histonas interactúan entre sí y con el ADN en esta entidad fundamental de la estructura de la cromatina.

Referencia clave: “Estructura cristalina de la partícula del núcleo del nucleosoma a una resolución de 2.8 Å” por Luger, K. Mader, A., Richmond, R.K., Sargent, D.F. & Richmond, T.J. in Nature 389:251-260 (1997)

Interacciones de histonas a través del pliegue de histonas

Las histonas centrales tienen una cola amino-terminal altamente cargada positivamente, y la mayor parte del resto de la proteína forma un dominio a-helicoidal. Cada histona central tiene al menos 3 a-hélices.

Figura 4.28

El dominio a-helicoidal forma un pliegue histónico característico, en el que las hélices a1 y a3 más cortas son perpendiculares a la hélice a2 más larga. Las hélices a están separadas por dos bucles, L1 y L2. El pliegue histónico es el dominio de dimerización entre pares de histonas, mediando la formación de heterodímeros en forma de media luna H3-H4 y H2A-H2B. Los motivos histono-veces de las parejas en un par son antiparalelos, de manera que el bucle L1 de uno es adyacente al bucle L2 del otro.

Figura 4.29

Ahora se ha visto una estructura muy similar al pliegue histónico en otras proteínas nucleares, como algunas subunidades de TFIID, componente clave en la maquinaria general de transcripción de eucariotas. También sirve como dominio de dimerización para estas proteínas.

Dos heterodímeros H3-H4 se unen para formar un tetrámero.

Los nucleosomas son las subunidades de la fibra de cromatina

La fibra de cromatina más extendida es de aproximadamente 10 nm de diámetro. Se compone de una serie de complejos de histona-ADN llamados nucleosomas.

Las principales líneas de evidencia para esta conclusión son:

1. Las observaciones de esta fibra de 10 nm en el microscopio electrónico mostraron una serie de cuerpos que parecían perlas en una cuerda. Ahora reconocemos las perlas como los núcleos nucleosómicos y la cadena como el enlazador entre ellos.
2. La digestión del ADN en la cromatina o núcleos con nucleasa micrococcal libera una serie de productos que contienen ADN de longitudes discretas. Cuando el ADN de los productos de la digestión de nucleasas microcócicas se ejecutó en un gel de agarosa, se encontró que era una serie de fragmentos de 200 pb, 400 pb, 600 pb, 800 pb, etc., es decir, múltiplos integrales de 200 pb. Esto demostró que la escisión por esta nucleasa, que tiene muy poca especificidad de secuencia, se restringió a regiones discretas en la cromatina. Esas regiones de escisión son los enlazadores.
3. Los estudios físicos, que incluyen datos tanto de difracción de neutrones como de difracción de electrones en fibras y más recientemente difracción de rayos X de cristales, han proporcionado información estructural más detallada.

2. El núcleo nucleosómico está compuesto por un octámero de histonas con 146 pb de ADN dúplex envuelto alrededor de él en 1.65 giros muy apretados. El octámero de histonas es en realidad un tetrámero H32H42 en el eje central, flanqueado por dos dímeros H2A-H2B (uno en cada extremo del núcleo.

Figura 4.30. Vistas esquemáticas del núcleo nucleosómico

La fibra de 10 nm está compuesta por una cadena de núcleos nucleosómicos unidos por ADN enlazador. La longitud del ADN enlazador varía entre tejidos dentro de un organismo y entre especies, pero un valor común es de aproximadamente 60 pb. El nucleosoma es el núcleo más el enlazador, y por lo tanto contiene aproximadamente 200 pb de ADN.

Figura 4.31. Una cadena de nucleosomas

Estructura detallada del núcleo nucleosómico.

Trayectoria del ADN y empaquetamiento apretado

Los 146 pb de ADN se envuelven alrededor del octámero de histonas en 1.65 vueltas de una superhélice torroidal plana y zurda. Así, 14 giros o “giros” del ADN están en los 1.65 giros superhelicoidales, presentando 14 surcos mayores y 14 menores al octámero de histonas. La DNasa I pancreática escindirá el ADN en la superficie del núcleo aproximadamente cada 10 pb, cuando cada torsión del ADN se expone en la superficie.

La superhélice de ADN tiene un radio promedio de 41.8 Å y un paso de 23.9 Å. Esta es una envoltura muy apretada del ADN alrededor de las histonas en el núcleo - ¡tenga en cuenta que el ADN dúplex en un turno está a solo unos pocos Å del ADN en el siguiente turno! El ADN no está uniformemente doblado en esta superhélice. A medida que el ADN se envuelve alrededor de las histonas, los surcos mayores y luego menores se comprimen, pero no de manera uniforme para todos los giros del ADN. El ADN rico en G+C favorece la compresión del surco mayor, mientras que el ADN rico en A+T favorece la compresión del surco menor. Esta es una característica importante en el posicionamiento traduccional de nucleosomas y también podría afectar la afinidad de diferentes ADN por las histonas en nucleosomas.

Los fosfatos de ADN tienen alta movilidad cuando no entran en contacto con las histonas; los fosfatos de ADN que se enfrentan al disolvente son mucho más móviles de lo que se ve con otros complejos proteína-ADN.

Figura 4.32. Una vista transversal del núcleo del nucleosoma que muestra heterodímeros de histonas y contactos con ADN. Estas imágenes corresponden a las proteínas y ADN en aproximadamente la mitad del nucleosoma.

Las superbobinas torroidales zurdas de ADN en núcleos nucleosómicos son el equivalente a una superbobina diestra, de ahí negativa. Por lo tanto, el ADN en los nucleosomas está efectivamente subenrollado.

Figura 4.33.

Histonas en la partícula del núcleo del nucleosoma

El octámero proteico está compuesto por cuatro dímeros (2 pares H2A-H2B y 2 pares H3-H4) que interactúan a través del “pliegue histónico”. Los dos pares H3-H4 interactúan a través de un haz de 4 hélices formado entre las dos proteínas H3 para hacer el tetrámero H32H42. Cada par H2A-H2B interactúa con el tetrámero H32H42 a través de un segundo haz de 4 hélices entre los pliegues de histonas H2B y H4.

Las regiones histónicas del tetrámero H32H42 se unen al centro del ADN cubriendo un total de aproximadamente 6 giros del ADN, o 3 giros de ADN por dímero H3-H4. Los de los dímeros H2A-H2B cubren una cantidad comparable de ADN, 3 giros por dímero. Regiones helicoidales adicionales se extienden desde las regiones de plegamiento de histonas y son una parte integral de la proteína central dentro de los confines de la superhélice de ADN.

Interacciones histona-ADN en la partícula central.

El dominio histone-fold de los heterodímeros (H3-H4 y H2A-H2B) se une a 2.5 vueltas de doble hélice de ADN, generando una curva de 140˚. La interacción con el ADN ocurre en dos tipos de sitios:

1. Los bucles L1 más L2 en los extremos estrechadamente cónicos de cada heterodímero forman un sitio de unión a ADN similar para cada par de histonas. Los bucles L1-L2 interactúan con el ADN en cada extremo de las 2.5 vueltas de ADN.
2. Las hélices a1 de cada pareja en un par forman la superficie convexa en el centro del sitio de unión al ADN. Las interacciones principales son los enlaces H entre los aminoácidos y la cadena principal de fosfato del ADN (hay poca especificidad de secuencia para la unión de histona-ADN). Sin embargo, hay algunas excepciones, como el contacto hidrófobo entre H3Leu65 y el 5-metilo en la timina. Una cadena lateral Arg de un pliegue histónico ingresa a la ranura menor en 10 de las 14 veces que mira hacia el octámero de histonas. Las otras 4 ocurrencias tienen cadenas laterales Arg de regiones de cola que penetran en la ranura menor.

Colas de Histonas

Las colas histonas N y C-termiales constituyen aproximadamente 28% de la masa de las proteínas histonas centrales, y se ven más de 1/3 de su longitud total en el mapa de densidad electrónica, es decir, que gran parte de su longitud es relativamente inmóvil en la estructura.

Las colas de H3 y H2B pasan a través de canales en la superhélice de ADN creados por 2 surcos menores yuxtapuestos. Un segmento de cola H4 hace una fuerte conexión entre partículas, quizás relevante para la estructura de orden superior de los nucleosomas.

Las regiones más N-terminales de las colas de histonas no están muy ordenadas en la estructura cristalina de rayos X. Estas regiones se extienden desde el núcleo del nucleosoma y, por lo tanto, podrían estar involucradas en interacciones entre partículas. Los sitios para acetilación y desacetilación de lisinas específicas se encuentran en estos segmentos de las colas que sobresalen del núcleo. Las modificaciones postraduccionales como la acetilación se han implicado en la “remodelación de la cromatina” para permitir o ayudar a la unión del factor de transcripción. Parece probable que estas modificaciones estén afectando las interacciones entre núcleos nucleosómicos, pero no cambiando la estructura de la partícula central.

Enlaces externos

• Algunos excelentes recursos están disponibles en la World Wide Web para visualizar e investigar más a fondo la estructura de la cromatina y su participación en procesos nucleares.
• Dmitry Puss mantiene un sitio con muchas buenas imágenes, incluyendo una vista dinámica paso a paso del núcleo nucleosómico comenzando con los dominios de pliegue histónico y terminando con un núcleo completo, con ADN. www.average.org/~prus/nucleosome.html
• Otro buen sitio es de J.R. Bone: rampages.onramp.net/~jrbone/chrom.html

Estructura de cromatina de orden superior

1. La fibra de 10 nm compuesta por núcleos nucleosómicos y espaciadores se pliega en estructuras de orden superior para gran parte del ADN en la cromatina. De hecho, la fibra de 10 nm con aspecto de cuentas sobre una cuerda en el microscopio electrónico se preparó a concentraciones muy bajas de sal y está libre de histona H1.
2. En presencia de H1 y a concentraciones salinas más fisiológicas, la cromatina forma una fibra de 30 nm. La estructura exacta de esta fibra sigue siendo un punto de considerable debate, y no se puede descartar la posibilidad de una estructura múltiple en esta fibra.
3. Un modelo reaonable es que la fibra de 10 nm se enrolla alrededor de sí misma para generar un solenoide de 30 nm de diámetro, con 6 nucleosomas por vuelta del solenoide.

La histona H1 se une a la superficie externa del núcleo nucleosómico, interactuando en los puntos de entrada y salida del ADN. Las moléculas H1 se pueden reticular entre sí con reactivos químicos, lo que indica que las proteínas H1 también interactúan entre sí. Las interacciones entre las proteínas H1, cada una unida a un núcleo nucleosómico, pueden ser una de las fuerzas que impulsan la formación de la fibra de 30 nm.

Figura 4.34. Modelo para una vuelta del solenoide en la fibra de 30 nm.

4. Cada nivel de estructura de cromatina produce una disposición más compacta del ADN. Esto se puede describir en términos de una relación de empaquetamiento, que es la longitud del ADN en un estado extendido dividido por la longitud del ADN en el estado más compacto.

Para la fibra de 10 nm, la relación de empaquetamiento es de aproximadamente 7, es decir, hay 7mm de ADN por mm de fibra de cromatina. La relación de empaquetamiento en el núcleo es mayor (ver problemas), pero esto no incluye el ADN adicional, menos compactado en el espaciador. En la fibra de 30 nm, la relación de empaquetamiento es de aproximadamente 40, es decir, hay ADN de 40 mm por mm de fibra de cromatina.

5. La fibra de 30 nm es probablemente el constituyente básico tanto de la cromatina interfásica como de los cromosomas mitóticos. Se puede compactar aún más mediante bobinas y bucles adicionales. Uno de los temas clave en la regulación génica es la naturaleza de la fibra cromadadora en la eucromatina transcripcionalmente acativa. ¿Es la fibra de 10 nm? la fibra de 30 nm? alguna modificación de este último? o incluso alguna estructura de orden superior? Estos son temas para la investigación actual.

Colaboradores y Atribuciones

• Ross C. Hardison, T. Ming Chu Profesor de Bioquímica y Biología Molecular (La Universidad Estatal de Pensilvania)