12.E: Procesamiento de ARN (Ejercicios)

12.1 Los nucleósidos trifosfatos marcados con [32P] en la posición a, b o g son útiles para monitorear diversos aspectos de la transcripción. Para el proceso específico enumerado en a-c, dar la posición de la etiqueta que sea apropiada para examinar ese paso.

a) Iniciación por ARN polimerasa de E. coli.

b) Formando el extremo 5' del ARNm eucariota.

c) Elongación por ARN polimerasa eucariota II.

12.2 (POB) Procesamiento posttranscripcional del ARN.

Predecir los efectos probables de una mutación en la secuencia (5') AAUAAA en un transcrito de ARNm eucariota.

12.3 Un mecanismo de transferencia de fosfoéster (o transesterificación) se observa frecuentemente en el empalme y otras reacciones que involucran ARN. ¿Son verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones sobre estos mecanismos?

a) El mecanismo requiere la escisión de enlaces de alta energía del ATP.

b) El nucleófilo iniciador para el corte y empalme de intrones del Grupo I (incluyendo el intrón del pre-ARNr de Tetrahymena) es el hidroxilo 3' de un nucleótido guanina.

c) El nucleófilo iniciador para el corte y empalme del pre-ARNm nuclear es el hidroxilo 2' de un nucleótido interno de adenina.

d) Las reacciones individuales en las transferencias de fosfoéster son reversibles, pero el proceso general es esencialmente irreversible debido a la circularización (incluye la formación de lariat) del intrón extirpado.

12.4 ¿Qué propiedades comparten el mecanismo de corte y empalme de los intrones mitocrónicos fúngicos de Tetrahymena pre-ARNr y del Grupo II?

12.5 Por favor, responda estas preguntas sobre el empalme de precursores a ARNm.

a) ¿Qué dinucleótidos se encuentran casi invariablemente en los sitios de empalme 5' y 3' de los intrones?

b) ¿Qué componente de empalme se une en la unión de empalme 5'?

c) ¿Qué nucleótidos se unen por la estructura de ramificación en el intrón durante el corte y empalme?

d) ¿Para qué se utiliza el ATP durante el corte y empalme de precursores al ARNm?

12.6 (POB) Corte y empalme de ARN.

¿Cuál es el número mínimo de reacciones de transesterificación necesarias para empalmar un intrón de un transcrito de ARNm? ¿Por qué?

12.7 Coincidir las siguientes afirmaciones con el proceso de corte y empalme eucariota apropiado enumerado en las partes a-c.

1) Un nucleósido o nucleótido guanina inicia una reacción de fosfotransferencia concertada.

2) Las secuencias consenso en las uniones de empalme son AG'GUAAGU... YYYAG'G ('es la unión, Y = cualquier pirimidina).

3) El empalme se realiza en dos etapas separadas, cortando para generar un 3'-fosfato seguido de una ligadura dependiente de ATP.

4) El empalme no requiere factores proteicos.

5) El empalme requiere pequeños complejos de ribonucleoproteína nuclear U1.

a) Empalme de pre-ARNm.

b) Empalme de pre-ARNt en levadura

c) Empalme de pre-ARNr en Tetrahymena

12.8 La enzima RNasa H escindirá cualquier ARN que esté en un heterodúplex con ADN. Por lo tanto, se puede escindir un ARN monocatenario en cualquier ubicación específica hibridando primero un oligodesoxirribonucleótido corto que es complementario a esa ubicación y luego tratándolo con RNasa H.

Este enfoque es útil para determinar la estructura de los intermedios de empalme. Consideremos un caso hipotético que se muestra en la siguiente figura. Después de la incubación del ARN precursor radiomarcado (exón1-intrón-exón2) con un extracto nuclear capaz de realizar el corte y empalme, los productos se analizaron en un gel desnaturalizante de poliacrilamida. Los resultados mostraron que los exones se unieron como ARN lineal, pero el intrón escindido se movió mucho más lento que un ARN lineal del mismo tamaño, indicativo de alguna estructura no lineal. El intrón escindido se hibridó a un oligodesoxirribonucleótido corto que es complementario a la región en el sitio de corte y empalme 5' (oligo 1 marcado en la figura), se trató con RNasa H y se analizó en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. El producto corrió como un ARN lineal con el tamaño del intrón escindido (menos la longitud del sitio de escisión de RNasa H). Como se resume en la figura, el intrón escindido se analizó por recocido (por separado) con otros tres oligodesoxirribonucleótidos, seguido de tratamiento con RNasa H y electroforesis en gel. El uso del oligodesoxirribonucleótido número 2 generó una molécula en forma de Y, el uso del oligodesoxirribonucleótido número 3 generó una molécula en forma de V con un extremo 5' y 2 extremos 3', y el uso del oligodesoxirribonucleótido número 4 generó un círculo y un ARN lineal corto.

a) ¿Qué te dice el resultado con el oligodesoxirribonucleótido 2?

b) ¿Qué le dice el resultado con oligodesoxirribonucleótido 4?

c) ¿Qué le dice el resultado con el oligodesoxirribonucleótido 1?

d) ¿Qué le dice el resultado con oligodesoxirribonucleótido 3?

e) ¿Cuál es la estructura del intrón extirpado? Muestra las ubicaciones de los oligos complementarios en tu dibujo.