19.E: Regulación transcripcional en eucariotas (Ejercicios)

19.1 (POB) Fijación específica de ADN por proteínas reguladoras.

Una proteína represora procariota típica discrimina entre su sitio específico de unión a ADN (operador) y ADN inespecífico por un factor de 105 a 106. Alrededor de diez moléculas del represor por célula son suficientes para asegurar un alto nivel de represión. Supongamos que existía un represor muy similar en una célula humana y tenía una especificidad similar para su sitio de unión. ¿Cuántas copias del represor se requerirían por célula para provocar un nivel de represión similar al que se ve en la célula procariota? (Pista: El genoma de E. coli contiene alrededor de 4.7 millones de pares de bases y el genoma haploide humano contiene alrededor de 2.4 mil millones de pares de bases).

Utilice la siguiente información para los siguientes 3 problemas. Imaginemos que parte de la regulación de la expresión del gen OB está mediada por una proteína que llamaremos OBF1. Hay un sitio de unión para OBF1 en el gen OB, y supongamos que es el único sitio de unión específico en el genoma haploide, o 2 sitios específicos en un genoma diploide. El genoma humano haploide tiene aproximadamente 3 x 109 pb, o 6 x 109 pb en un genoma diploide. Si asumimos que aproximadamente 33.3% del ADN nuclear está en una conformación de cromatina accesible, eso significa que aproximadamente 2 x 109 pb de ADN están disponibles para unirse a OBF1 de forma no específica.

19.2 El diámetro de un núcleo de mamífero es de aproximadamente 10 mm. Si modelas un núcleo como esfera, ¿cuál es su volumen? ¿Cuál es la concentración molar de sitios de unión específicos e inespecíficos en el núcleo?

La unión de OBF1 a un sitio específico y a sitios inespecíficos se describe mediante las siguientes ecuaciones.

Dejar P = OBF1

Ds = un sitio de unión específico en el ADN

Dns = un sitio de unión inespecífico en el ADN genómico

P + Ds

Ks = = 1011 M-1 (eqn 2)

Kns = = 105 M-1 (eqn 3)

19.3 ¿Qué fracción del OBF1 (o P en las ecuaciones) no está ligada a sitios específicos o inespecíficos en el ADN?

19.4 ¿Cuántas moléculas de OBF1 se necesitan por núcleo para mantener el 90% de ocupación de los sitios específicos? Esta condición significa

= 9

Utilice la siguiente información para las siguientes siete preguntas.

El gen agutí en ratones controla la cantidad y distribución de pigmentos dentro de los pelos del pelaje. Algunas mutaciones de este gen también conducen a obesidad de inicio en adultos, un síndrome leve similar a la diabetes, susceptibilidad tumoral y letalidad embrionaria recesiva. El gen codifica una proteína predicha de 131 aminoácidos que tiene las características estructurales de una proteína secretada, pero no se ha reconocido una homología sorprendente con otras proteínas conocidas. Es probable que esta proteína sea un regulador de la síntesis de pigmentos de melanina, y también puede ser un regulador metabólico más general.

Supongamos que está investigando la regulación del gen agouti, y tiene la capacidad de transfecta una línea celular de melanocitos, que transcribe el gen agouti de tipo silvestre, y una línea celular de adipocitos, que transcribe el gen agouti de tipo silvestre solo a un nivel muy bajo nivel. Además, ya se sabe que el promotor basal se encuentra en un segmento de ADN localizado entre -100 y +50. Se realizan deleciones progresivas en 5' de un fragmento que incluye -300 a +50, lo vinculan a un gen informador de luciferasa y se transfeccionan los constructos en células de melanocitos y adipocitos, con los siguientes resultados.

19.5. ¿Qué concluye sobre la región entre -250 y -200?

19.6. ¿Qué concluye sobre la región entre -200 y -150?

19.7. ¿Qué concluye sobre la región entre -150 y -100?

También investiga la unión de proteínas nucleares a estos segmentos de ADN localizados aguas arriba del gen agutí. Los extractos que contenían proteínas nucleares de melanocitos se probaron para determinar la capacidad de unirse a los fragmentos delineados en la serie de deleción anterior.

El fragmento de -150 a -100 se utilizó como sonda marcada en un ensayo de desplazamiento de movilidad. La movilidad de la sonda libre se muestra en el carril 1, y el patrón después de la unión al extracto nuclear de melanocitos se muestra en el carril 2. Los carriles 3-14 muestran los cambios de movilidad después de la adición de los competidores a la reacción de unión; el triángulo por encima de los carriles indica que se usa una cantidad creciente de competidor en carriles sucesivos. “" "Self "” es el mismo fragmento de -150 a -100 que se usa como sonda, pero no está marcado y está presente en exceso sobre la sonda marcada (carriles 3-5).” Se utilizó un ADN completamente diferente (ADN de E. coli esquilado) como competidor inespecífico (carriles 6-8). También se probaron dos oligonucleótidos dúplex diferentes, uno que contenía el sitio de unión para AP1 (carriles 9-11) y el otro que contenía el sitio de unión para Sp1 (carriles 12-14). Las cajas más delgadas y menos densamente rellenas denotan bandas de menor intensidad que las bandas más oscuras y gruesas. Utilice estos resultados para responder a las dos preguntas siguientes.

19.8. ¿Qué concluye de estos datos?

19.9. ¿Qué secuencia dentro del segmento -150 a -100 podría esperar que esté unida en los núcleos de melanocitos?

19.10. El fragmento de -200 a -150 también se utilizó como sonda marcada en un ensayo de desplazamiento de movilidad similar al descrito para el segmento -150 a -100, como se muestra a continuación.

¿Qué concluye de estos datos?

19.11. Algunos alelos mutantes del gen agutí se expresan ectópicamente (es decir, en el tejido equivocado). Solo usando la información sobre las deleciones 5' anteriores, ¿qué región es probable candidata para la posición de una mutación de pérdida de función que conduzca a la expresión ectópica en el tejido adiposo?

19.12 (POB) Dominios funcionales en proteínas reguladoras.

Un bioquímico reemplaza el dominio de unión a ADN de la proteína GAL4 de levadura con el dominio de unión a ADN del represor lambda (CI) y encuentra que la proteína modificada ya no funciona como un activador transcripcional (ya no regula la transcripción del operón GAL en levadura). ¿Qué podría hacerse con el sitio de unión de GAL4 en el ADN para hacer que la proteína modificada sea funcional en la activación de la transcripción del operón GAL?

19.13 ¿Cuál es el dominio de unión a ADN del factor de transcripción Sp1?

19.14 ¿Cuál es el dominio de dimerización del factor de transcripción AP1?

19.15 (ASC) Describir tres mecanismos para regular la actividad de los factores de transcripción.

19.16 (ASC) Se ha construido un conjunto de plásmidos que contiene una serie de inserciones de nucleótidos espaciadas a lo largo del gen del receptor de glucocorticoides. Cada inserción codifica tres o cuatro aminoácidos. Las posiciones del mapa de las diversas inserciones en la secuencia codificante del gen receptor son las siguientes:

Secuencia codificante del receptor de glucocorticoides 783

| |

| |

| |

Inserción: A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S

Los plásmidos que contienen el gen receptor pueden expresarse funcionalmente en células CV-1 y COS, que contienen un gen sensible a esteroides. Mediante estas células, se determina el efecto de cada una de estas inserciones en el receptor sobre la inducción del gen sensible a esteroides y en la unión del esteroide sintético dexametasona. Los resultados de estos análisis se resumen en la siguiente tabla.

Inserción Inducción Dexametasona

A ++++ ++++

B ++++ ++++

C ++++ ++++

D 0 ++++

E 0 ++++

F 0 ++++

G ++++ ++++

H ++++ ++++

I + ++++

J ++++ ++++

K 0 ++++

L 0 ++++

M 0 ++++

N + ++++

O ++++ ++++

P ++++ ++++

Q 0 0

R 0 0

S 0 0

tipo salvaje ++++ ++++

a) A partir de este análisis, ¿cuántos dominios funcionales diferentes tiene el receptor de glucocorticoides? Indicar la posición de estos dominios en relación con el mapa de inserción.

b) ¿Qué dominio es el dominio de unión a esteroides?

c) ¿Cómo podría determinar cuál de los dominios es el dominio de unión al ADN?