7.25D: Pernos Occidentales
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Objetivos de aprendizaje
- Mostrar los usos de Western Blots
La transferencia Western (a veces llamada inmunotransferencia de proteínas) es una técnica analítica ampliamente aceptada utilizada para detectar proteínas específicas en una muestra dada de homogeneizado o extracto de tejido. Las muestras de transferencia Western se pueden tomar de tejido completo o de cultivo celular. Los tejidos sólidos primero se descomponen mecánicamente usando una licuadora (para volúmenes de muestra más grandes), un homogeneizador (volúmenes más pequeños) o mediante sonicación. Se pueden emplear diversos detergentes, sales y tampones para estimular la lisis de las células y solubilizar proteínas. La técnica utiliza electroforesis en gel para separar proteínas nativas por estructura 3-D o proteínas desnaturalizadas por la longitud del polipéptido.
Las proteínas se transfieren luego a una membrana (típicamente nitrocelulosa o PVDF), donde se tiñen con anticuerpos específicos para la proteína diana. Actualmente hay muchas compañías de reactivos que se especializan en proporcionar anticuerpos (tanto monoclonales como policlonales) contra decenas de miles de proteínas diferentes pertenecientes a vías de señalización o antígenos receptores de superficie celular, u otros componentes celulares o solubles. Los anticuerpos comerciales pueden ser costosos, aunque el anticuerpo no unido se puede reutilizar entre experimentos. Este método se utiliza en los campos de la biología molecular, bioquímica, inmunogenética y otras disciplinas de biología molecular. Otras técnicas relacionadas incluyen el uso de anticuerpos para detectar proteínas en tejidos y células mediante inmunotinción y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Este método se originó en el laboratorio de George Stark en Stanford. El nombre Western blot fue dado a la técnica por W. Neal Burnette y es una obra de teatro sobre el nombre Southern blot, una técnica para la detección de ADN desarrollada anteriormente por Edwin Southern. La detección de ARN se denomina Northern blot.
Puntos Clave
- Después de la separación por electroforesis en gel usando SDS-PAGE, las proteínas se transfieren a una hoja de papel secante especial llamada nitrocelulosa, aunque se pueden usar otros tipos de papel, o membranas. Las proteínas conservan el mismo patrón de separación que tenían en el gel.
- La transferencia se incuba con una proteína genérica (como las proteínas de la leche) para unirse a cualquier lugar pegajoso restante en la nitrocelulosa. Luego se agrega un anticuerpo a la solución que es capaz de unirse a su proteína específica. El anticuerpo se conjuga con fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante.
- La ubicación del anticuerpo se revela incubándolo con un sustrato incoloro que la enzima unida convierte en un producto coloreado que puede ser visto y fotografiado.
Términos Clave
- electroforesis: un método para la separación y análisis de moléculas grandes (como proteínas) mediante la migración de una solución coloidal de ellas a través de un gel; electroforesis en gel