7.25E: Turnos de Movilidad del ADN

El ensayo de desplazamiento de movilidad del ADN es una técnica para estudiar la regulación génica y determinar las interacciones proteína-ADN.

Objetivos de aprendizaje

• Identificar la utilidad de los ensayos de desplazamiento de movilidad del ADN

Puntos Clave

• La interacción de las proteínas con el ADN es fundamental para el control de muchos procesos celulares, incluyendo replicación, recombinación y reparación del ADN, transcripción y ensamblaje viral.
• Una ventaja de estudiar las interacciones proteína-ADN mediante un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética es la capacidad de resolver complejos de diferente estequiometría o conformación.
• La fuente de la proteína de unión al ADN puede ser un extracto nuclear crudo o de células enteras, un producto de transcripción in vitro o una preparación purificada.

Términos Clave

• poliacrilamida: Cualquiera de una gama de polímeros reticulados de acrilamida; utilizados para formar geles blandos.

Un ensayo de cambio de movilidad es la separación electroforética de una mezcla de proteína-ADN o proteína-ARN en un gel de poliacrilamida o agarosa por un corto período. La velocidad a la que diferentes moléculas (y combinaciones de las mismas) se mueven a través del gel está determinada por su tamaño y carga, y en menor medida, su forma. El carril de control (una sonda de ADN sin proteína presente) contendrá una sola banda correspondiente al fragmento de ADN o ARN no unido. Sin embargo, suponiendo que la proteína es capaz de unirse al fragmento, el carril con proteína presente contendrá otra banda que representa el complejo más grande, menos móvil, de sonda de ácido nucleico unida a la proteína, que se “desplaza” hacia arriba en el gel (ya que se ha movido más lentamente).

Figura: Ensayo de desplazamiento en gel: El carril 1 es un control negativo, y contiene solo ADN. El carril 2 contiene proteína así como un fragmento de ADN que, basado en su secuencia, no interactúa. El carril 3 contiene proteína y un fragmento de ADN que reacciona; el complejo resultante es más grande, más pesado y de movimiento más lento. El patrón mostrado en el carril 3 es el que resultaría si todo el ADN estuviera unido y no se produjera disociación del complejo durante la electroforesis. Cuando no se cumplen estas condiciones, se puede observar una segunda banda en el carril 3 reflejando la presencia de ADN libre o la disociación del complejo ADN-proteína.

Bajo las condiciones experimentales correctas, la interacción entre el ADN y la proteína se estabiliza y la relación de ácido nucleico unido a no unido en el gel refleja la fracción de moléculas sonda libres y unidas a medida que la reacción de unión ingresa al gel. Esta estabilidad se debe en parte a la baja fuerza iónica del tampón, pero también a un “efecto de jaulas”; la proteína, rodeada por la matriz de gel, es incapaz de difundirse lejos de la sonda antes de recombinarse. Si se conocen las concentraciones iniciales de proteína y sonda, y si se conoce la estequiometría del complejo, se puede determinar la afinidad aparente de la proteína por la secuencia de ácido nucleico. Un anticuerpo que reconozca la proteína se puede agregar a esta mezcla para crear un complejo aún mayor con un mayor desplazamiento. Este método se conoce como un ensayo de superdesplazamiento, y se utiliza para identificar inequívocamente una proteína presente en el complejo proteína-ácido nucleico.