7.25F: Purificación de proteínas por etiqueta de afinidad
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Las etiquetas proteicas son secuencias peptídicas injertadas genéticamente en una proteína recombinante.
Objetivos de aprendizaje
- Indicar los usos de las etiquetas de afinidad de proteínas
Puntos Clave
- Las etiquetas de afinidad se agregan a las proteínas para que puedan purificarse a partir de su fuente biológica bruta usando una técnica de afinidad.
- Las proteínas recombinantes que portan pequeñas etiquetas de afinidad se expresan de manera eficiente en bacterias, insectos o células de mamíferos.
- Después de la lisis celular y el aclaramiento del lisado, las proteínas etiquetadas se purifican mediante un procedimiento de cromatografía de afinidad de metal inmovilizado.
Términos Clave
- proteína: Las proteínas son moléculas biológicas grandes que consisten en una o más cadenas de aminoácidos.
- afinidad: Una fuerza atractiva entre los átomos, o grupos de átomos, que contribuye a formar sus enlaces.
- recombinante: Este término se refiere a algo formado al combinar elementos existentes en una nueva combinación. Así, la frase ADN recombinante se refiere a un organismo creado en el laboratorio mediante la adición de ADN de otra especie.
Las etiquetas proteicas son secuencias peptídicas injertadas genéticamente en una proteína recombinante. A menudo, estas etiquetas son removibles por agentes químicos o por medios enzimáticos, como la proteólisis o el empalme de inteína. Las etiquetas se adhieren a las proteínas para diversos fines.
Las etiquetas de afinidad se agregan a las proteínas para que puedan purificarse a partir de su fuente biológica bruta usando una técnica de afinidad. Estos incluyen proteína de unión a quitina (CBP), proteína de unión a maltosa (MBP) y glutatión-S-transferasa (GST). La etiqueta poly (His) es una etiqueta de proteína ampliamente utilizada; se une a matrices metálicas.
Se utilizan etiquetas de solubilización, especialmente para proteínas recombinantes expresadas en especies deficientes en chaperonas como E. coli, para ayudar en el correcto plegamiento de las proteínas y evitar que precipiten. Estos incluyen tiorredoxina (TRX) y poli (NANP). Algunas etiquetas de afinidad tienen un doble papel como agente de solubilización, como MBP y GST.
Las etiquetas de cromatografía se utilizan para alterar las propiedades cromatográficas de la proteína para proporcionar una resolución diferente a través de una técnica de separación particular. Estos a menudo consisten en aminoácidos polianiónicos, como FLAG-tag.
Las etiquetas de epítopos son secuencias peptídicas cortas que se eligen porque los anticuerpos de alta afinidad pueden producirse de manera confiable en muchas especies diferentes. Estos suelen derivarse de genes virales, los cuales explican su alta inmunorreactividad. Las etiquetas de epítopos incluyen la etiqueta V5, la etiqueta c-myc y la etiqueta HA. Estas etiquetas son particularmente útiles para experimentos de transferencia Western, inmunofluorescencia e inmunoprecipitación, aunque también encuentran uso en la purificación de anticuerpos.
Las etiquetas de fluorescencia se utilizan para dar lectura visual en una proteína. GFP y sus variantes son las etiquetas de fluorescencia más utilizadas. Las aplicaciones más avanzadas de GFP incluyen su uso como indicador de plegado (fluorescente si está plegado, incoloro si no).
Las etiquetas proteicas también son útiles para la modificación enzimática específica (como las etiquetas de biotina ligasa) y la etiqueta de modificación química (FlASH). A menudo, las etiquetas se combinan para producir modificaciones multifuncionales de la proteína. Sin embargo, con la adición de cada etiqueta viene el riesgo de que la función nativa de la proteína pueda ser abolida o comprometida por interacciones con la etiqueta.
Los ejemplos de etiquetas peptídicas incluyen:
- Avitag, un péptido que permite la biotinilación por la enzima BirA y así la proteína puede ser aislada por estreptavidina (GLNDIFEAQKIEWHE)
- Calmodulina-tag, un péptido unido por la proteína calmodulina (KRRWKKNFIAVSAANRFKKKISSSGAL)
- FLAG-tag, un péptido reconocido por un anticuerpo (DYKDDDDK)
- Etiqueta HA, un péptido reconocido por un anticuerpo (YPYDVPDYA)
- Etiqueta His, 5-10 histidinas unidas por un quelato de níquel o cobalto (HHHHHH)
- Myc-tag, un péptido corto reconocido por un anticuerpo (EQKLISEDL)
- Etiqueta S (KETAAAAKFERQHMDS)
- SBP-tag, un péptido que se une a estreptavidina (MDEKTTGWRGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)
- Softag 1, para expresión en mamíferos (SLAELLNAGLGGS)
- Softag 3, para expresión procariota (TQDPSRVG)
- Etiqueta V5, un péptido reconocido por un anticuerpo (GKPIPNPLLGLDST)
- Etiqueta Xpress (DLYDDDDK)
Los ejemplos de etiquetas proteicas incluyen:
- BCCP (Biotin Carboxyl Carrier Protein), un dominio proteico reconocido por estreptavidina
- Glutatión-S-transferasa-tag, una proteína que se une al glutatión inmovilizado
- Etiqueta de proteína fluorescente verde, una proteína que es espontáneamente fluorescente y puede unirse por nanocuerpos
- Etiqueta de proteína de unión a maltosa, una proteína que se une a amilosa agarosa
- Etiqueta NUS
- Strep-tag, un péptido que se une a la estreptavidina o a la estreptavidina modificada llamada estreptactina (Strep-tag II: WSHPQFEK)
- Etiqueta de tiorredoxina