7.25G: Análisis de Extensión de Imprimación
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La extensión del cebador se utiliza para mapear los extremos 5' de los fragmentos de ADN o ARN.
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE
Análisis de extensión de cebador de esquema
PUNTOS CLAVE
Puntos Clave
- El ensayo de extensión del cebador se realiza hibridando un cebador oligonucleotídico específico a una posición aguas abajo de ese extremo 5'.
- El cebador está radiomarcado, generalmente en su extremo 5'. Esta se extiende con transcriptasa inversa, que puede copiar ya sea un molde de ARN o ADN, haciendo un fragmento que termina en el extremo 5' de la molécula molde.
- El análisis de extensión del cebador incluye la selección y preparación de un cebador marcado complementario al transcrito de ARN de interés; hibridación del cebador a una región del ARN en estudio; extensión del cebador por una ADN polimerasa dependiente de ARN para sintetizar una cadena de ADNc.
- El análisis de la extensión del cebador de los productos de ADNc extendido se realiza en geles desnaturalizantes de poliacrilamida y autorradiografía.
Términos Clave
- radiomarcado: Etiquetado con un radiotrazador.
- poliacrilamida: Cualquiera de una gama de polímeros reticulados de acrilamida; utilizados para formar geles blandos.
Análisis de Extensión de Primer
La extensión del cebador es una técnica mediante la cual se pueden mapear los extremos 5' del ARN o ADN. La extensión del cebador se puede usar para determinar el sitio de inicio de la transcripción de ARN para un gen conocido. Esta técnica requiere un cebador radiomarcado (generalmente de 20 a 50 nucleótidos de longitud) que es complementario a una región cercana al extremo 3' del gen. El cebador se deja hibridar con el ARN y se usa transcriptasa inversa para sintetizar ADNc a partir del ARN hasta que alcanza el extremo 5' del ARN. Al ejecutar el producto en un gel de poliacrilamida, es posible determinar el sitio de inicio de la transcripción, ya que la longitud de la secuencia en el gel representa la distancia desde el sitio de inicio hasta el cebador radiomarcado.
Aplicaciones del Análisis de Extensión de Imprimación
El análisis de extensión de cebadores tiene tres aplicaciones principales. En primer lugar, se utiliza para mapear el extremo 5' de las transcripciones. Esto permite determinar el sitio de inicio de la transcripción (asumiendo que el ARNm no se procesa más), lo que ayuda a localizar promotores o cajas TATA. En segundo lugar, se puede utilizar para cuantificar la cantidad de transcripción en un sistema de transcripción in vitro.
En tercer lugar, se puede utilizar para determinar las localizaciones de roturas o bases modificadas en una población mixta de muestras de ARN o ADN. Esto es útil en aplicaciones como la huella. Se utilizan dos métodos diferentes. En uno, el nucleótido modificado no puede ser reconocido por la polimerasa o transcriptasa inversa; en tales casos, la cadena termina en el sitio de modificación. En la otra, la modificación se convierte en una etapa posterior del análisis en una rotura de hebra por tratamiento químico. Por ejemplo, los sitios de modificaciones por sulfato de dimetilo (DMS) pueden identificarse tratando el ADN con DMS, exponiendo la muestra a condiciones que rompen el esqueleto en el sitio de modificación, seguido de la extensión del cebador.