4.10: ESI-QTOF-MS acoplado a HPLC y su aplicación para la inocuidad de los alimentos
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ESI-QTOF-MS Acoplado a HPLC y su Aplicación para la Seguridad Alimentaria
La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es un método de separación muy potente ampliamente utilizado en ciencias ambientales, industria farmacéutica, investigación biológica y química y otros campos. Generalmente, se puede utilizar para purificar, identificar y/o cuantificar uno o varios componentes en una mezcla simultáneamente.
La espectrometría de masas (EM) es una técnica de detección mediante la medición de la relación masa-carga de especies iónicas. El procedimiento consta de diferentes pasos. Primero, se inyecta una muestra en el instrumento y luego se evapora. En segundo lugar, las especies en la muestra se cargan mediante ciertos métodos ionizados, como la ionización electrónica (EI), la ionización por electronebulización (ESI), la ionización química (IC), la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI). Finalmente, las especies iónicas serán analizadas dependiendo de su relación masa-carga (m/z) en el analizador, como cuadrupolo, tiempo de vuelo (TOF), trampa de iones y resonancia de ciclotrón iónico por transformada de fourier.
La identificación espectrométrica de masas es ampliamente utilizada junto con la separación cromatográfica. Los más comunes son la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) y la cromatografía líquida-espectrometría de masas (CL-EM). Debido a la alta sensibilidad, selectividad y precio relativamente bajo de GC-MS, tiene aplicaciones muy amplias en la detección de fármacos, análisis ambientales, etc. Para esos grupos de investigación en química orgánica, también es un equipo de uso diario y conveniente. Sin embargo, la GC-MS es ineficaz si las moléculas tienen un alto punto de ebullición y/o se descomponen a alta temperatura.
En este módulo, se hablará principalmente de cromatografía líquida y espectrometría de masas cuadrupolo de ionización por electrospray (LC/ESI-QTOF-MS). Como se mencionó anteriormente, el LC tiene una capacidad eficiente de separación y MS tiene una alta sensibilidad y una fuerte capacidad de caracterización estructural. Además, TOF-MS, tiene varias propiedades distintivas en la parte superior de la EM regular, incluyendo tasas de adquisición rápidas, alta precisión en las mediciones de masa y un amplio rango de masa. La combinación de LC y ESI-TOF-MS nos permite obtener un potente en el análisis cuantitativo y cualitativo de moléculas en matrices complejas mediante la reducción de las interferencias matriciales. Puede desempeñar un papel importante en el área de la inocuidad de los alimentos.
Cómo funciona
Generalmente, LC-MS tiene cuatro componentes, incluyendo un automuestreador, HPLC, fuente de ionización y espectrómetro de masas, como se muestra en la Figura\(\PageIndex{1}\). Aquí hay que prestar atención a la interfaz de HPLC y MS para que puedan ser adecuados entre sí y estar conectados. Se especifican columnas de separación para HPLC-MS, cuyo diámetro interno (I.D.) suele ser de 2.0 mm. Y el caudal, que es de 0.05 a 0.2 ml/min, es más lento que el típico HPLC. Para la fase móvil, utilizamos la combinación de agua y metanol y/acetonitrilo. Y debido a que los iones inhibirán las señales en MS, si queremos modificar a fase móvil, el modificador debe ser volátil, como HCO 2 H, CH 3 CO 2 H, [NH 4] [HCO 2] y [NH 4] [CH 3 CO 2].
Como interfaz entre HPLC y MS, la fuente de ionización también es importante. Hay muchos tipos y ESI y la ionización química a presión atmosférica (APCI) son los más comunes. Ambos están trabajando a presión atmosférica, alta tensión y alta temperatura. En ESI, el eluyente de columna se nebulizó en campo de alto voltaje (3 - 5 kV). Entonces habrá gotita cargada muy pequeña. Finalmente se formaron iones individuales en este proceso y entra en espectrómetro de masas.
Comparación de ESI-QTOF-MS y otros métodos de espectrómetro de masas
Hay muchos tipos de espectrómetros de masas que pueden conectarse con la HPLC. Uno de los sistemas MS más utilizados es el espectrómetro de masas de cuadrupolo único, que no es muy caro, como se muestra en la Figura\(\PageIndex{2}\). Este sistema cuenta con dos modos. Un modo es el modo de monitoreo de iones totales (TIM) que puede proporcionar el cromatógrafo de iones totales. El otro es el modo de monitoreo de iones (SIM) seleccionado, en el que el usuario puede elegir monitorear algunos iones específicos, y la sensibilidad de este último es mucho mayor que la de los primeros Además, la resolución de masa del espectrómetro de masas de cuadrupolo único es de 1 Da y su mayor rango de masas de detección es 30 - 3000 Da.
El segundo sistema MS es el sistema MS-MS de triple cuadrupolo, mostrado en la Figura\(\PageIndex{3}\). Usando este sistema, las personas pueden seleccionar algunos iones, llamados iones padres, y usar otro haz de electrones para colisionarlos nuevamente y obtener los iones fragmentos, llamados iones hijos. En otras palabras, hay dos pasos para seleccionar las moléculas diana. Por lo que reduce mucho el efecto matriz. Este sistema es muy útil en el análisis de muestras biológicas porque las muestras biológicas siempre tienen una matriz muy compleja; sin embargo, la resolución masiva sigue siendo de 1 Da.
El tercer sistema es el MS de tiempo de vuelo (TOF), que se muestra en la Figura\(\PageIndex{4}\), que puede proporcionar un espectro de mayor resolución de masa, de 3 a 4 decimales de Da. Además, puede detectar un rango de masa muy grande a una velocidad muy rápida. El rango de masa de detección más grande es de 20 - 10000 Da. Pero el precio de este tipo de EM es muy alto. La última técnica es un espectrómetro de masas híbrido, Q-TOF MS, que combina un solo cuadrupolo MS y un TOF MS. Usando esta EM, podemos obtener cromatógrafo de alta resolución y también podemos usar el sistema MS-MS para identificar las moléculas diana.
Aplicación de LC/ESI-QTOF-MS en la Detección de Quinolonas en Alimentos Comestibles para Animales
Las quinolonas son una familia de medicamentos veterinarios antibacterianos comunes que pueden inhibir la DNA-girasa en las células bacterianas. Sin embargo, los residuos de quinolona en productos animales comestibles pueden ser directamente tóxicos o causar patógenos resistentes en humanos. Por lo tanto, se requieren métodos sensibles para monitorear dichos residuos posiblemente presentes en diferentes alimentos productores de animales, como huevos, pollo, leche y pescado. Las estructuras moleculares de ocho quinolonas, ciprofloxacino (CIP), metanosulfonato de anofloxacina (DAN), enrofloxacina (ENR), difloxacina (DIF), sarafloxacina (SARA), oxolínico, ácido (OXO), flumequina (FLU), ofloxacina (OFL), se muestran en la Figura\(\PageIndex{5}\).
La CL-EM es un enfoque de detección común en el campo de la inocuidad de los alimentos. Pero debido a la compleja matriz de las muestras, siempre es difícil detectar aquellas moléculas diana de baja concentración mediante el uso de MS de cuadrupolo único A continuación se da un ejemplo de la aplicación de LC/ESI-QTOF-MS.
Utilizando un sistema de bombeo cuaternario, un sistema Q-TOF-MS, una columna C18 (250 mm × 2.0 mm I.D., 5 µm) con un caudal de 0.2 ml/min, y una mezcla de solventes como fase móvil que comprende 0.3% de solución de ácido fórmico y acetonitrilo. El foarchivo de gradiente para la fase móvil se muestra en la Tabla\(\PageIndex{1}\). Dado que en condiciones de pH ácido, las quinolonas portaban una carga positiva, todos los espectros de masas se adquirieron en el modo de iones positivos y resumiendo 30,000 espectros individuales en el rango de masas de 100-500 Da.
| Tiempo (min) | % en volumen de solución de ácido fórmico | % en volumen de acetonitrilo |
| 0 | 80 | 20 |
| 12 | 65 | 35 |
| 15 | 20 | 80 |
| 20 | 15 | 85 |
| 30 | 15 | 85 |
| 30.01 | 80 | 20 |
Los parámetros óptimos de trabajo de la fuente de ionización fueron los siguientes: voltaje capilar 4.5 kV; energía iónica del cuadrupolo 5 eV/z; temperatura seca 200 °C; nebulizador 1.2 bar; gas seco 6.0 L/min. Durante los experimentos, se utilizó HCO 2 Na (62 Da) para calibrar externamente el instrumento. Debido a la alta precisión de masa del espectrómetro de masas TOF, puede reducir extremadamente los efectos de la matriz. En la Figura se muestran tres cromatógrafos diferentes\(\PageIndex{6}\). El superior es el cromatógrafo iónico total en el rango de ventana de 400 Da. Es imposible distinguir las moléculas diana en este cromatógrafo. El medio está a una resolución Da, que es la resolución del espectrómetro de masas de cuadrupolo único. En este cromatógrafo se pueden identificar algunas de las moléculas. Pero la intensidad del ruido sigue siendo muy alta y hay varios picos de impurezas con relaciones masa/carga similares en el cromatógrafo. El de abajo tiene una resolución de 0.01 Da. Muestra claramente los picos de ocho quinolonas con muy alta relación señal/ruido. En otras palabras, debido a las rápidas tasas de adquisición y la alta precisión de masa, la LC/TOF-MS puede reducir significativamente los efectos de la matriz.
El cuadrupolo MS se puede utilizar para confirmar aún más las moléculas diana. La figura\(\PageIndex{7}\) muestra los cromatogramas obtenidos en la confirmación de CIP (17.1 ng/g) en una muestra de leche positiva y ENR (7.5 ng/g) en una muestra de pescado positiva. Los cromatógrafos de iones progenitores se muestran en el lado izquierdo. En el lado derecho, se encuentran los espectros de masas de iones hijos característicos de CIP y ENR.
Inventivos de LC/Q-TOF-MS
Algunos de los inconvenientes de LC/Q-TOF-MS son sus altos costos de compra y mantenimiento. Es difícil aplicar este método en la detección diaria en el área de protección ambiental e inocuidad alimentaria.
Para reducir el efecto matriz y mejorar la sensibilidad de detección, las personas pueden utilizar algunos métodos de preparación de muestras, como la extracción líquido-líquido (LLE), la extracción en fase sólida (SPE), la destilación. Pero estos métodos consumirían gran cantidad de muestras, disolvente orgánico, tiempo y esfuerzos. Hoy en día, aparecen algunos nuevos métodos de preparación de muestras. Por ejemplo, las personas pueden usar la microdiálisis en línea, la extracción de fluidos supercríticos (SFE) y la extracción de líquidos presurizados. En el método mencionado en la parte Aplicación, utilizamos microextracción en fase sólida en tubo (SPME) en línea, que es una excelente técnica de preparación de muestras con las características de pequeño volumen de muestra, simplicidad de extracción sin disolvente y fácil automatización.