4.2: Antecedentes

Hay una serie de cuestiones que deben considerarse al medir los espectros de RMN para fines de análisis cuantitativo. Muchos de estos problemas se refieren a la forma en que se adquieren y procesan los datos de RMN. Por lo general, es necesario realizar mediciones de RMN cuantitativas con cuidado para obtener resultados cuantitativos precisos y precisos. Las ventajas de la RMN sobre otros métodos espectroscópicos son que no se necesita factor de respuesta y todas las resonancias generadas por un núcleo particular (por ejemplo ¹ H, ³¹ P o ¹⁹ F) tienen una intensidad integrada directamente proporcional a la concentración molar del analito. y al número de núcleos que dan lugar a esa resonancia.

\[\mathrm{\dfrac{Integral\: Area}{Number\: of\: Nuclei} ∝ Concentration} \label{E1}\]

La resonancia de RMN ^1H de un grupo metilo tendría 3 veces la intensidad de un pico resultante de un solo protón. Por ejemplo, el 3- (trimetilsilil) tetrapropionato de sodio TSP, tiene una resonancia de metilo equivalente a 9 protones (de los tres grupos metilo) y por lo tanto daría lugar a una resonancia que es 9 veces mayor que la intensidad resultante de un solo protón.

Para este experimento, se utilizará KHP (hidrógeno ftalato de potasio) como estándar de cuantificación interna. El KHP tiene la ventaja de ser un estándar primario, lo que significa que después del secado, su concentración de solución puede calcularse directamente a partir de su masa. También puede desear que utilice una referencia de turno químico interno, como TSP-d ₄ en la preparación de sus soluciones. El TSP no es un estándar primario, y se sabe que se adsorbe a superficies de vidrio lo que puede cambiar su concentración de solución con el tiempo, por lo tanto no es un estándar de cuantificación útil. Como referencia de desplazamiento químico, TSP-d ₄ tiene la ventaja de producir una sola resonancia aguda con un desplazamiento químico definido de 0.00 ppm.

El ácido málico y los ácidos cítricos son los principales ácidos orgánicos en los frutos. La Q-NMR es una técnica valiosa para determinar las cantidades de compuestos mayores y menores en los jugos de frutas. Al comparar la integral de resonancia de un analito con la de un compuesto estándar de concentración conocida, podemos determinar la concentración de analito de acuerdo con la siguiente ecuación:

\[C_{analyte} = \dfrac{I_{analyte} × C_{std}}{I_{std}} \label{E2}\]

donde el _analito C es la concentración de analito, C _std es la concentración estándar de cuantificación, y I _analito e I _std son las áreas de las resonancias del analito y el patrón, respectivamente, normalizado al número de protones que dan lugar a cada resonancia.

La exactitud y precisión de las mediciones integrales se ven afectadas por los siguientes factores experimentales.

• espectral S/N
• forma de línea
• calidad de shimming
• línea base
• funciones de ventana de apodización
• correcciones de fase, línea de base y deriva

La superposición de resonancia es un problema potencial en la cuantificación precisa por RMN. Este problema a veces se puede resolver seleccionando cuidadosamente el pH, usando un disolvente diferente o agregando un reactivo para cambiar el desplazamiento químico del analito (es decir, reactivos de desplazamiento de lantánidos). En algunos casos, el espectro de RMN ^1H puede estar demasiado abarrotado para una cuantificación precisa, pero otro núcleo, por ejemplo ¹⁹ F o ¹³ C, que tiene una ventana de desplazamiento químico más grande podría producir resonancias bien separadas de los componentes de la mezcla.

Bloqueo de frecuencia de campo

Los campos de imanes superconductores tienden a derivar durante un período de minutos a horas causando pérdida de resolución. La mayoría de los espectrómetros modernos están equipados con un canal de bloqueo que regula el campo del espectrómetro monitoreando el desplazamiento químico de una resonancia de deuterio del solvente. A medida que el campo magnético deriva, el cambio en la frecuencia de resonancia de deuterio genera una señal de error que indica tanto la magnitud como la dirección del cambio de campo, permitiendo la compensación por un circuito de retroalimentación. Los solventes deuterados no viscosos proporcionan el mejor bloqueo de frecuencia de campo debido a sus resonancias agudas e intensas. En los experimentos de RMN ^1H una ventaja adicional de preparar muestras en disolventes deuterados es que se reduce la intensidad de la resonancia protónica del disolvente. La resonancia de solventes próticos (por ejemplo, H ₂ O, o CH ₃ CN) puede oscurecer las resonancias de RMN del analito ^1H y reducir el rango dinámico de la medición. Si bien es común suprimir las resonancias de RMN ^1H de los disolventes próticos, también se suprimirán las resonancias de analitos con desplazamientos químicos similares. En ocasiones no es posible hacer la solución de muestra en un disolvente deuterado, por ejemplo cuando la muestra ya es líquida (es decir, plasma sanguíneo, orina o jugo de frutas). En tal caso, se agrega a la muestra una cantidad suficiente de un disolvente deuterado, como 10% D ₂ O, para proporcionar la señal de bloqueo.

Supresión de Solventes

Además de la afinación precisa de la sonda y la calibración del ancho de pulso, la supresión efectiva de la resonancia del solvente a menudo es crucial para que la resonancia del analito se observe en muestras acuosas. Hay una serie de métodos de supresión de solventes disponibles para su uso en experimentos de RMN, el más simple de los cuales es la presaturación. La presaturación utiliza un pulso selectivo para igualar las poblaciones de los espines solventes. Es importante evaluar el efecto de los parámetros de presaturación de solventes sobre la resolución y sensibilidad del experimento para asegurar buenos resultados. La potencia de presaturación debe seleccionarse de tal manera que la resonancia del disolvente se atenúe significativamente sin reducir la intensidad de las resonancias de analitos vecinos.

Tiempo de repetición

El tiempo entre adquisiciones sucesivas es crucial en Q-NMR. Para determinar el retardo de relajación longitudinal de un protón analito dado, se utiliza la secuencia de impulsos de recuperación de inversión para medir los tiempos de relajación _T1. La secuencia de pulsos utiliza un programa de calibración que ajusta los datos a la ecuación de decaimiento exponencial

\[I(τ) = I_0\left(1 − 2 × e^{\Large\frac{−τ}{T_1}}\right) \label{E3}\]

donde I (τ) es la intensidad de la resonancia de protones seleccionada para un valor de τ dado, I ₀ la intensidad en equilibrio (infinito τ), τ es el valor del retardo de inversión y _T1 es la constante de tiempo de primer orden para la relajación longitudinal.

Contenido de ácido málico y cítrico de los frutos

En la siguiente tabla se resumen los resultados obtenidos del análisis cuantitativo de RMN del contenido de ácido málico y cítrico de diversos frutos. ¹

	Ácido málico	Ácido cítrico
Manzana*	3.42-10.12 g/L	0.09-0.36 g/L
Albaricoque	4.59	4.13
Pera	2.55	1.05
Kiwi	2.66	11.00
Naranja	2.13	11.71
Fresa	1.74	7.13
Piña	1.33	5.99

*Los datos obtenidos de tres manzanas variaron entre los valores dados.