9.2: CIERVO

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El experimento DEER de cuatro pulsos

El experimento más utilizado para las mediciones de distribución de distancia en el rango nanométrico es el experimento de resonancia electrónica doble de cuatro pulsos (DEER) (Figura 9.2), que a veces también se conoce como experimento de doble resonancia de electrones pulsados (PELDOR). Todas las interacciones del espín del observador se reenfocan dos veces por dos\(\pi\) pulsos a veces\(2 \tau_{1}\) y\(2 \tau_{1}+2 \tau_{2}\) después del\(\pi / 2\) pulso inicial. El reenfoque repetido es necesario ya que todos los paquetes de giro deben estar en fase\(t=0\) y la superposición del pulso de la bomba con el\(\pi\) pulso del\(\pi / 2\) observador conduciría a la distorsión de la señal. El primer reenfoque con retardo interpulso\(\tau_{1}\) restaura la situación (1) inmediatamente después del\(\pi / 2\) pulso con fase\(x\), donde los vectores de magnetización de todos los paquetes de giro se alinean con el\(-y\) eje. \({ }^{1}\)En la práctica, la coherencia se excita en ambas transiciones de giro del observador (azul en los paneles de nivel de energía), pero para mayor claridad consideramos solo la coherencia del giro del observador que está en la transición superior y está simbolizada por una línea ondulada en el panel (1).

Durante el tiempo\(t\) posterior al primer reenfoque, los vectores de magnetización de paquetes de giro con diferente compensación de resonancia desfasan (panel (2)). Solo el paquete de giro en resonancia, marcado en azul oscuro, todavía está alineado con la\(-y\) dirección. El pulso de la bomba voltea el compañero de acoplamiento y, por lo tanto, transfiere la coherencia a la transición de giro inferior del observador La frecuencia de resonancia de esta transición es desplazada por el acoplamiento dipolo-dipolo\(d\) en todos los paquetes de giro. La magnetización de giro del observador se desfase aún más hasta el momento justo antes de la aplicación del segundo\(\pi\) pulso de observador (3)) y, además, todo el paquete de vectores de magnetización de paquetes de espín precede en sentido contrario a las agujas del reloj con el desplazamiento de frecuencia\(d\). El paquete de espín originalmente en resonancia gana así la fase\(d\left(\tau_{2}-t\right)\) antes de que se aplique el segundo\(\pi\) pulso de observador. El segundo\(\pi\) pulso de observador con fase\(x\) corresponde a una\(180^{\circ}\) rotación alrededor del\(x\) eje. Esto refleja el haz de vectores de magnetización con respecto al\(y\) eje, invirtiendo la fase de la coherencia de espín del observador (panel (4)). El haz, que aún precede en sentido antihorario con frecuencia angular,\(d\) ahora retrasa el\(+y\) eje por fase\(d\left(\tau_{2}-t\right)\). Durante el retardo interpulso final de longitud,\(\tau_{2}\) el haz como un conjunto gana fase\(d \tau_{2}\) (flecha gris en el panel (4) y simultáneamente se vuelve a alinear a lo largo de su centro debido al reenfoque de eco. Sin embargo, el centro correspondiente al paquete de giro originalmente en resonancia no termina a lo largo\(+y\), como lo habría hecho en ausencia del pulso de la bomba. Más bien, este paquete de giro ha ganado fase\(d t\) con respecto a la\(+y\) dirección (panel (5)). El componente del vector de magnetización a lo largo\(+y\), que corresponde a la señal de eco, viene dado por\(\cos (d t)\).

El rango de distancia del experimento DEER está limitado hacia distancias cortas por el requisito de que, para el reenfoque de eco, los pulsos del observador deben excitar ambas transiciones del observador, las cuales se dividen por\(d\) y, para la transferencia de coherencia, el pulso de la bomba debe excitar ambas transiciones del acoplamiento pareja, que también están divididos por\(d\). En otras palabras, tanto la subsecuencia de eco reenfocada del observador como el pulso de bombeo deben tener un ancho de banda de excitación que exceda\(d\). Este requisito establece un límite de distancia más bajo de aproximadamente\(1.8 \mathrm{~nm}\) a frecuencias de banda X y de aproximadamente\(1.5 \mathrm{~nm}\) a frecuencias\(Q\) de banda. Surge un límite hacia largas distancias, ya que es necesario observar varias oscilaciones dipolares para inferir el ancho o incluso la forma de una distribución de distancia y al menos se necesita observar una oscilación para determinar la distancia media. Esto requiere\(t>2 \pi / d\). Por otro lado, tenemos\(t<\tau_{2}\) y el retardo interpulso fijo\(\tau_{2}\) no puede ser mucho mayor que el tiempo de relajación transversal\(T_{2}\), ya que de lo contrario la coherencia se ha relajado completamente y no se observan ecos. Los tiempos de relajación transversal del espín electrónico son del orden de unos pocos microsegundos. Dependiendo del tipo de muestra (ver Sección\(9.1 .2\)), se\(\tau_{2}\) puede elegir entre\(1.5\) y\(20 \mu \mathrm{s}\), correspondiente a distancias máximas observables entre 5 y\(12 \mathrm{~nm}\).

Requerimientos de muestra

En la vía de transferencia de coherencia deseada del experimento DEER, los pulsos de observador excitan exclusivamente los giros del observador y el pulso de la bomba excita exclusivamente al compañero de acoplamiento. El ancho de banda de excitación debe ser suficientemente grande para cubrir el acoplamiento dipolo-dipolo\(d\) en todas las orientaciones, es decir, mayor que\(\omega_{\|}-2 \omega_{\perp}\). Si los dos espines acoplados tienen el mismo espectro EPR, este espectro debe ser más amplio que el doble de este ancho de banda de excitación mínimo. Esta condición se cumple para las etiquetas de espín de nitroxido (Capítulo 10) y los iones de metales de transición en todas las frecuencias EPR, mientras que algunos radicales orgánicos, como los radicales tritilo, tienen espectros que son demasiado estrechos a frecuencias de banda X o incluso banda Q. Además,\(T_{2}\) debe ser lo suficientemente largo para que al menos el observador gire. Esta condición puede cumplirse para casi todas las\(S=1 / 2\) especies a temperaturas de\(10 \mathrm{~K}\) (complejos de metales de transición) o\(50 \cdots 80 \mathrm{~K}\) (radicales orgánicos), pero puede requerir enfriamiento\(4.2 \mathrm{~K}\) por debajo para algunas especies de alto espín. Para especies de espín alto con una concha de valencia medio llena, como Mn (II)\((S=5 / 2)\) o temperaturas de\(\mathrm{Gd}(\mathrm{III})(S=7 / 2)\) medición de también\(10 \mathrm{~K}\) son suficientes.

La concentración de la muestra debe ser suficientemente baja para que las distancias intermoleculares sean mucho más largas que las distancias intramoleculares. Para distancias cortas\(200 \mu \mathrm{M}\) son posibles concentraciones de hasta, pero las concentraciones de\(10 \cdots 50 \mu \mathrm{M}\) proporcionan mejores resultados, si se dispone de un espectrómetro con suficiente sensibilidad. Dependiendo de la distancia y\(T_{2}\), las mediciones se pueden realizar hasta concentraciones de\(10 \cdots 1 \mu \mathrm{M}\). Para las proteínas de membrana reconstituidas en liposomas, la calidad de los datos no es solo una función de la concentración de espín en masa, sino también de la relación lípido-proteína. Este parámetro necesita ser optimizado para cada nueva proteína. El volumen de muestra requerido varía entre unos pocos microlitros (frecuencias de banda W) y\(150 \mu \mathrm{L}\) siendo las frecuencias\(50 \mu \mathrm{L}\) en banda Q generalmente óptimas.

Si la concentración no es demasiado alta y se puede alcanzar el límite de baja temperatura de relajación transversal,\(T_{2}\) depende de la concentración y tipo de protones alrededor del giro del observador. La deuteración del solvente y el crioprotector (generalmente glicerol) generalmente mejoran drásticamente la calidad de los datos. Si la matriz puede ser perdeuterada, la deuteración de la proteína o el ácido nucleico puede prolongar\(T_{2}\) y extender el rango de distancia o mejorar la relación señal/ruido.

Las complicaciones surgen si se encuentran más de dos electrones desapareados en una misma molécula, pero estas complicaciones suelen resolverse. Sin embargo, ninguno de los pares de espín debe tener una distancia más corta que el límite inferior del rango de distancia accesible.

¹ Esto supone que el\(\pi\) pulso observador tiene fase\(y\). Si tiene fase\(x\), el vector de magnetización está a lo largo\(+y\) después del primer reenfoque y todos los paneles de magnetización siguientes se reflejan con respecto al\(x\) eje.