9.9: La Química Orgánica de la Ingeniería Genética

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Muchas enzimas que catalizan reacciones que involucran los enlaces fosfato diéster del ADN han sido aprovechadas para su uso en ingeniería genética, técnicas en las que copiamos, cortamos y empalmamos ADN para crear versiones personalizadas de genes. Las herramientas de la ingeniería genética se han vuelto indispensables y comunes en la última década, y la mayoría de los investigadores que trabajan en el lado biológico de la química las utilizan ampliamente. Los días de purificar minuciosamente una enzima a partir de cultivos bacterianos o hígados de vaca molidos prácticamente se han ido. Ahora los científicos clonan el gen que codifica la enzima, realizan los cambios deseados (mediante mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo), y utilizan un huésped como E. coli o levadura para producir la enzima 'recombinante' a partir del gen clonado. Aprenderás los detalles de muchos de estos procedimientos en un curso de bioquímica o biología molecular. En lo que nos centraremos ahora es aplicar lo que hemos aprendido sobre las reacciones de transferencia de grupos fosfato para que podamos reconocer parte de la química orgánica que está sucediendo en un experimento de clonación.

Lo primero que hay que hacer en un procedimiento de clonación de genes es copiar una cadena de ADN. Esto se logra mediante una enzima llamada ADN polimerasa (EC 2.7.7.7), que utiliza una sola hebra de ADN como molde para sintetizar una segunda cadena complementaria (la imagen completa de este complejo proceso está mucho más allá del alcance de este libro, pero recordemos que platicamos sobre el descubrimiento del ADN termoestable polimerasa en la introducción al capítulo 6).

puede haber aprendido en una clase de biología que el ADN se sintetiza en la dirección 3' a 5'. Observe a continuación que el grupo hidroxilo 3' en el extremo de la cadena de ADN en crecimiento ataca el a-fosfato de un 2'-desoxinonucleósido trifosfato (dNTP), expulsando pirofosfato inorgánico.

Reacción de ADN polimerasa:

Los científicos son capaces de cortar ADN usando enzimas 'tijeras moleculares' llamadas endonucleasas de restricción que escinden el ADN bicatenario por hidrólisis en secuencias de bases específicas.

Hidrólisis de ADN por endonucleasas de restricción:

Observe que el resultado de esta reacción de escisión hidrolítica es un segmento de ADN con un grupo hidroxi en la posición 3', y un segundo segmento con un grupo fosfato en la posición 5'.

Una endonucleasa de restricción comúnmente utilizada llamada 'BamHI' escinde ADN bicatenario específicamente en la siguiente secuencia de 6 bases:

Observe que se realiza un corte 'escalonado': esta es una propiedad común (y útil) de muchas endonucleasas, aunque algunas hacen cortes 'romos'.

Mientras que una endonucleasa escinde un enlace fosfodiéster en una cadena de ADN, la ADN ligasa (EC 6.5.1.1) logra el proceso inverso: cataliza la formación de un nuevo enlace 3'-5' entre dos cadenas:

Reacción de ADN ligasa:

Obsérvese que inicialmente no hay ningún grupo saliente en el fosfato 5' del DNA2, lo que hace imposible una reacción de transferencia directa de fosfato. La estrategia empleada por la enzima ADN ligasa es activar primero el fosfato 5' del ADN 2 usando ATP (fase 1 a continuación), luego puede continuar la reacción de ligación (fase 2)

Ligación de ADN
El ADN reacciona con ATP para producir PPi y activarse para la transferencia de fosforilo

Se forma un nuevo enlace de ADN y se produce AMP.

Cabe mencionar una herramienta enzimática más en el arsenal de ingeniería genética. En algunos procedimientos de clonación, un investigador puede querer evitar la ligadura no deseada de ADN. Esto se puede lograr mediante el uso de la enzima fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1), que cataliza la desfosforilación de muchos fosfatos orgánicos diferentes, incluido el ADN 5'-fosforilado (recordemos que discutimos las fosfatasas en la sección 9.6).

Reacción de fosfatasa alcalina:

Con el grupo fosfato eliminado, la ligadura es imposible - ¡no hay forma de hacer un nuevo enlace fosfodiéster sin un grupo fosfato 5'!