2.26: Técnica de Extracción

LECTURA RELACIONADA: Páginas 125-126.

OBJETIVO

Al finalizar este ejercicio, discusión apropiada y lecturas relacionadas, el alumno podrá:

1. Comprender las técnicas de extracción líquido-líquido.
2. Purificar y concentrar un analito.

PRINCIPIO

Hay una serie de razones por las que se necesita algún tipo de etapa de extracción para un método analítico. Estos incluyen: eliminar material de muestra que puede destruir un componente del sistema analítico, (como una proteína, que puede “enfurecerse” una columna de HPLC), aumentar la especificidad del ensayo mediante la eliminación de compuestos interferentes, colocar el analito en un medio que permita una reacción de derivatización, y concentrar el analito para una mayor sensibilidad.

Así, en todos los casos, las técnicas de extracción eliminan el analito de su matriz de muestra inicial. Las técnicas de extracción pueden incluir: precipitación de proteínas, cromatografía en columna (intercambio iónico, resinas neutras, etc.) y extracción líquido-líquido. Esta última técnica es la más utilizada por su simplicidad. El analito se extrae típicamente en un disolvente orgánico volátil, permitiendo que el analito se concentre por evaporación del disolvente orgánico.

En este ejercicio, la bilirrubina en una muestra de suero se extraerá en cloroformo y la cantidad extraída se determinará mediante análisis espectrofotométrico. Esta técnica de extracción se utiliza a menudo para medir la bilirrubina en el líquido amniótico debido a que los métodos colorimétricos (Malloy-Evelyn o Jedrassik-Grof) carecen de sensibilidad y el análisis espectrofotométrico directo del líquido amniótico está sujeto a interferencia y carece de especificidad.

MATERIALES

• Piscina de suero que contiene una cantidad elevada conocida de bilirrubina
• Ccloroformo de grado espectral
• Espectrofotómetro
• Solución salina normal
• Tubos de centrífuga de 50 mL con tapa de vidrio (envueltos en papel de aluminio)
• Centrífuga

PROCEDIMIENTO

1. Diluir 3 mL de la reserva de suero 1:5 con solución salina normal (0.85%, NaCl 0.15M).
2. Por duplicado, pipetear 5 mL del suero diluido en tubos de centrífuga tapados de vidrio de 50 mL.
3. Añadir 10 mL de cloroformo a cada tubo de centrífuga.
4. Tapar los tubos de centrífuga y extraer agitando o agitando los tubos por 30 segundos. Centrifugar a bajas velocidades durante 3-5 minutos para separar las dos fases. Si una malla de proteína persiste en la capa de cloroformo (inferior) después de la centrifugación, divísela con una varilla agitadora de vidrio y recentrifugue.
5. Retira la mayor cantidad posible de la capa acuosa superior con una pipeta Pasteur y deséchala.
6. Use otra pipeta Pasteur para transferir cuidadosamente las capas de cloroformo a dos tubos de ensayo de 16 mm x 150 mm cubiertos con papel de aluminio. Evite la contaminación de la fase acuosa restante pasando la punta de la pipeta a la capa inferior antes de aspirar el fluido. Cubra y colóquelas en la oscuridad.
7. Tomar uno de los tubos de ensayo, y evaporar la muestra a sequedad pasando una corriente de aire o gas N2 sobre la superficie del líquido. La evaporación se puede apresurar colocando el tubo de ensayo en un baño de agua a 37°C. La evaporación debe realizarse en una campana o espacio de trabajo ventilado, ya que el cloroformo es tóxico.
8. Reconstituir el residuo en 1 mL de cloroformo. Mida los espectros de absorbancia de ambas soluciones de cloroformo de 350 nm a 550 nm a incrementos de 25 nm. Registre las lecturas de absorbancia en la hoja de datos.
9. Medir el espectro de absorbancia del suero diluido a las mismas longitudes de onda utilizadas en el paso #8. Registro en la hoja de datos.
10. Trazar todos los espectros en el papel cuadriculado proporcionado en la hoja de datos.

Preguntas de Discusión

1. ¿Por qué los tubos de centrífuga y los tubos de ensayo de vidrio están cubiertos con papel aluminio?
2. ¿Los espectros de las 3 soluciones (suero diluido y 2 extractos de cloroformo) son iguales? Si no, ¿puedes explicar las diferencias?
3. ¿Qué solución dio la mayor absorbancia a 450 nm? ¿Estas absorbancias reflejan acuradamente la concentración real de bilirrubina en cada solución? Si no, ¿por qué no?
4. ¿Cuál de las soluciones arrojó un espectro más parecido al representado en la siguiente figura?

Escaneo de líquido amniótico que muestra el método para determinar la absorbancia a 450 nm. La línea arbitraria (base) trazada de 375 a 525 nm muestra dónde se habría rastreado el escaneo si no hubiera pigmento de bilirrubina presente. La línea discontinua indica la absorbancia registrada (O.D. cuando la ordenada está en unidades de densidad óptica).

FICHA TÉCNICA, EJERCICIO #26

NOMBRE: ___________ FECHA: ___________

RESULTADOS

Mediciones de absorbancia:

Longitud de onda (nm)	Suero Diluido	10 mL de cloroformo	1 mL de cloroformo
350
375
400
425
450
475
500
525
550

Trace cada curva espectral en el papel cuadriculado semilogarítmico proporcionado en la página siguiente. Use una pluma de diferente color para cada muestra.

Mediante el método de tangente descrito en la página 433, se determina la absorbancia a 450 nm, corregida para la línea base.

Utilice la Ley de Beer, la absorbancia a 450 nm por el método tangente, el peso molecular de la bilirrubina (569 g/mol) y el coeficiente de extinción para bilirrubina de 60,700 L •mo1 ^-1 • cm ^-1 para calcular la concentración de bilirrubina en cada muestra.

CÁLCULOS

\[A = \epsilon c \ell\]

Muestra	A 450 del Método Tangente	Concentración de bilirrubina por cálculo de absorbancia		Bilirrubina calculada en suero diluido
		Umol/L	mg/L	Umol/L	mg/L
Suero diluido
10 mL de cloroformo
1 mL de cloroformo

La concentración real de bilirrubina en la muestra testigo es __________mg/L

Suponiendo 100% de extracción de la bilirrubina sérica en cloroformo, calcular la
concentración de bilirrubina en la muestra de suero diluida a partir de la concentración de bilirrubina en los extractos de cloroformo usando la siguiente fórmula:

\[[Bili]serum (vol. \; extracted) = [Bili]CHCl_{3} \; (vol. \; of\; CHCl_{3})\]

donde: [Bili] suero = concentración calculada de bilirrubina en suero diluido

[Bili] CHCl ₃ = concentración de bilirrubina medida en extractos de cloroformo

Registre los resultados anteriores y compare con el valor esperado basado en una dilución de cinco veces del valor conocido de la muestra de control de calidad.