1.6: Transformación celular

Última actualización

29 oct 2022
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- 1.5: Ligadura de Productos
- 1.7: Inoculación

Nathan Reyna, Ruth Plymale, & Kristen Johnson
Ouachita Babtist University & University of New Hampshire

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Transformación Celular: Transformación Zippy de Células Z-competentes

Introducción de ADN extraño en bacterias E. coli

La transformación bacteriana es cuando las células toman ADN extraño del ambiente. Las células pueden expresar la información genética que recibieron de este ADN extraño. (ThermoFisher)

Consejos antes de comenzar:

Dependiendo de la situación, particularmente cuando llegue a la fase de análisis y solicite un tipo diferente de chasis bacteriano, utilizará una variedad de células competentes. Asegúrate de saber qué celdas estás usando y si hay un protocolo específico para el tipo de celda. (Las bacterias competentes descritas en este protocolo son Zippy Competent JM109, ZymoResearch)
La mayoría de los plásmidos portan un gen marcador para una resistencia específica a antibióticos. Al complementar el medio de crecimiento con el antibiótico de elección, solo se propagarán las células que contengan el plásmido de interés. Debes conocer la resistencia antibiótica asociada a tu columna vertebral plasmídica!! (Ver Apéndice I)

Todas las células competentes se almacenan en el congelador -80. Pide ayuda al instructor cuando estés listo para obtener las celdas competentes. ¡Debes tener ICE, primero!

Materiales	Temperatura de almacenamiento
Células Bacterias Competentes Zippy	-80° C
Mezcla de ligadura	fresco/-20°C
Placa de agar LB c/antibiótico	Temperatura de la habitación/37 °C
SOC	4°C/Temperatura ambiente
Perlas de Vidrio Estéril	Temperatura de la habitación

Procedimiento: ¡Lee cada paso antes de comenzar!

1) Asegúrate de tener un plato caliente. Precaliente colocándolo en la incubadora a 37 °C o sacándolo a temperatura ambiente antes de iniciar el procedimiento. Consulte la codificación de colores (Apéndice I) para asegurarse de tener el tipo de placa LB+antibiótico apropiado!

2) Obtener hielo, luego solicitar celdas/Dejar que las células se descongelen durante 1-2 minutos en hielo. — Las 50 $\mu L$ células se pueden dividir en 2 tubos de 25 $\mu L$ cada uno para dos transformaciones diferentes si se usan inmediatamente para transformar diferentes plásmidos. (Si no tienes dos plásmidos para transformar, considera compartir con otro equipo).

3) Antes de que las células estén completamente descongeladas agregar 1 - 5 $\mu L$ de mezcla de ligación (plásmido) directamente a las células (no agregar al costado del tubo). Para obtener los mejores resultados, agregue la ligación plasmídica a las células mientras aún están fangosas.

4) Incubar en hielo durante 5 minutos.

5) Agregar 200 $\mu L$ de medios SOC sin antibiótico a la mezcla de ligadura celular.
(Cantidad de SOC = ~4X volumen de mezcla de célula+plásmido; así solo se necesitan 120 ul para la transformación de 25 ul)

6). Incubar con agitación suave (200-300 RPM) durante 1-2 hrs a 37°C. (1 hr va a funcionar bien pero se obtiene una mayor eficiencia de transformación con 2 h de crecimiento). Omita este paso si usa resistencia a la ampicilina y proceda directamente al paso 7.

7) Extender las células transformadas usando perlas de vidrio en una placa etiquetada templada (22-37 °C) que contiene antibiótico. Deje que las placas se sequen (37°C) antes de voltear las placas boca abajo. (No quieres que los medios/bacterias goteen sobre la tapa. Puedes voltear los platos temprano al día siguiente, si es necesario.)

8) Incubar durante la noche (18-20 hrs) a 37°C. Al día siguiente, retire las placas de la incubadora, selle las tapas con parafilm y almacene a 4°C.

Al día siguiente: Todas las colonias deben ser aproximadamente del mismo tamaño (diámetro). No es raro que con el ensamblaje 3A se vean solo de 1 a 10 colonias.

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