1.6: Transformación celular
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Introducción de ADN extraño en bacterias E. coli
La transformación bacteriana es cuando las células toman ADN extraño del ambiente. Las células pueden expresar la información genética que recibieron de este ADN extraño. (ThermoFisher)
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Consejos antes de comenzar:
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Todas las células competentes se almacenan en el congelador -80. Pide ayuda al instructor cuando estés listo para obtener las celdas competentes. ¡Debes tener ICE, primero!
| Materiales | Temperatura de almacenamiento |
|---|---|
| Células Bacterias Competentes Zippy | -80° C |
| Mezcla de ligadura | fresco/-20°C |
| Placa de agar LB c/antibiótico | Temperatura de la habitación/37 °C |
| SOC | 4°C/Temperatura ambiente |
| Perlas de Vidrio Estéril | Temperatura de la habitación |
Procedimiento: ¡Lee cada paso antes de comenzar!
1) Asegúrate de tener un plato caliente. Precaliente colocándolo en la incubadora a 37 °C o sacándolo a temperatura ambiente antes de iniciar el procedimiento. Consulte la codificación de colores (Apéndice I) para asegurarse de tener el tipo de placa LB+antibiótico apropiado!
2) Obtener hielo, luego solicitar celdas/Dejar que las células se descongelen durante 1-2 minutos en hielo. — Las 50\(\mu L\) células se pueden dividir en 2 tubos de 25\(\mu L\) cada uno para dos transformaciones diferentes si se usan inmediatamente para transformar diferentes plásmidos. (Si no tienes dos plásmidos para transformar, considera compartir con otro equipo).
3) Antes de que las células estén completamente descongeladas agregar 1 - 5\(\mu L\) de mezcla de ligación (plásmido) directamente a las células (no agregar al costado del tubo). Para obtener los mejores resultados, agregue la ligación plasmídica a las células mientras aún están fangosas.
4) Incubar en hielo durante 5 minutos.
5) Agregar 200\(\mu L\) de medios SOC sin antibiótico a la mezcla de ligadura celular.
(Cantidad de SOC = ~4X volumen de mezcla de célula+plásmido; así solo se necesitan 120 ul para la transformación de 25 ul)
6). Incubar con agitación suave (200-300 RPM) durante 1-2 hrs a 37°C. (1 hr va a funcionar bien pero se obtiene una mayor eficiencia de transformación con 2 h de crecimiento). Omita este paso si usa resistencia a la ampicilina y proceda directamente al paso 7.
7) Extender las células transformadas usando perlas de vidrio en una placa etiquetada templada (22-37 °C) que contiene antibiótico. Deje que las placas se sequen (37°C) antes de voltear las placas boca abajo. (No quieres que los medios/bacterias goteen sobre la tapa. Puedes voltear los platos temprano al día siguiente, si es necesario.)
8) Incubar durante la noche (18-20 hrs) a 37°C. Al día siguiente, retire las placas de la incubadora, selle las tapas con parafilm y almacene a 4°C.
Al día siguiente: Todas las colonias deben ser aproximadamente del mismo tamaño (diámetro). No es raro que con el ensamblaje 3A se vean solo de 1 a 10 colonias.