28.7: Cromatografía de exclusión por tamaño
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Hemos considerado dos clases de fases estacionarias de tamaño micrométrico en este capítulo: partículas de sílice y perlas de resina polimérica reticulada. Ambos materiales son porosos, con tamaños de poro que van desde aproximadamente 5—400 nm para partículas de sílice, y de 5 nm a 100 μm para resinas de poliestireno reticulado con divinilbenceno. En la cromatografía de exclusión por tamaño, que también se conoce por los términos cromatografía de exclusión molecular o de permeación en gel, la separación de solutos depende de su capacidad para entrar en los poros de la fase estacionaria. Los solutos más pequeños pasan proporcionalmente más tiempo dentro de los poros y tardan más en eluirse de la columna.
La selectividad de tamaño de una fase estacionaria se extiende sobre un rango finito. Todos los solutos significativamente más pequeños que los poros se mueven a través de todo el volumen de la columna y eluyen simultáneamente, con un volumen de retención, V r, de
\[V_{r}=V_{i}+V_{o} \label{12.3} \]
donde V i es el volumen de la fase móvil que ocupa el espacio de poro de la fase estacionaria y V o es el volumen de la fase móvil en el resto de la columna. El soluto más grande para el que se mantiene la Ecuación\ ref {12.3} es el límite de inclusión de la columna, o límite de permeación. Esos solutos demasiado grandes para entrar en los poros eluyen simultáneamente con un volumen de retención de
\[V_{r} = V_{o} \label{12.4} \]
La ecuación\ ref {12.4} define el límite de exclusión de la columna.
Para un soluto cuyo tamaño está entre el límite de inclusión y el límite de exclusión, la cantidad de tiempo que pasa en los poros de la fase estacionaria es proporcional a su tamaño. El volumen de retención para estos solutos es
\[V_{r}=DV_{i}+V_{o} \label{12.5} \]
donde D es la relación de distribución del soluto, que varía de 0 en el límite de exclusión a 1 en el límite de inclusión. La ecuación\ ref {12.5} asume que la exclusión por tamaño es la única interacción entre el soluto y la fase estacionaria que afecta a la separación. Por esta razón, las fases estacionarias que utilizan partículas de sílice se desactivan como se describió anteriormente, y las resinas poliméricas se sintetizan sin sitios de intercambio.
La cromatografía de exclusión por tamaño proporciona un medio rápido para separar moléculas más grandes, incluyendo polímeros y biomoléculas. Una fase estacionaria para proteínas que consiste en partículas con poros de 30 nm tiene un límite de inclusión de 7500 g/mol y un límite de exclusión de\(1.2 \times 10^6\) g/mol. Las mezclas de proteínas que abarcan un rango más amplio de pesos moleculares se separan uniendo en serie varias columnas con diferentes límites de inclusión y exclusión.
Otra aplicación importante de la cromatografía de exclusión por tamaño es la estimación del peso molecular (PM) de un soluto. Las curvas de calibración se preparan usando una serie de patrones de peso molecular conocido y midiendo el volumen de retención de cada patrón. Como se muestra en la Figura 28.7.1 , una gráfica de log (MW) versus V r es aproximadamente lineal entre el límite de exclusión y el límite de inclusión. Debido a que el volumen de retención de un soluto está influenciado tanto por su tamaño como por su forma, una estimación razonablemente precisa del peso molecular solo es posible si los estándares se eligen cuidadosamente para minimizar el efecto de la forma.
La cromatografía de exclusión por tamaño se lleva a cabo utilizando instrumentación HPLC convencional, reemplazando la columna HPLC por una columna de exclusión por tamaño apropiada. Un detector UV/Vis es el medio más común para obtener el cromatograma.