11.3: Espectroscopia de correlación de fluorescencia
- Page ID
- 69624
\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \)
\( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)
\( \newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)
( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\)
\( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\)
\( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\)
\( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\)
\( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)
\( \newcommand{\id}{\mathrm{id}}\)
\( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)
\( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\)
\( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\)
\( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\)
\( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\)
\( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\)
\( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\)
\( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\)
\( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}\)
\( \newcommand{\vectorA}[1]{\vec{#1}} % arrow\)
\( \newcommand{\vectorAt}[1]{\vec{\text{#1}}} % arrow\)
\( \newcommand{\vectorB}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \)
\( \newcommand{\vectorC}[1]{\textbf{#1}} \)
\( \newcommand{\vectorD}[1]{\overrightarrow{#1}} \)
\( \newcommand{\vectorDt}[1]{\overrightarrow{\text{#1}}} \)
\( \newcommand{\vectE}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash{\mathbf {#1}}}} \)
\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \)
\( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)
\(\newcommand{\avec}{\mathbf a}\) \(\newcommand{\bvec}{\mathbf b}\) \(\newcommand{\cvec}{\mathbf c}\) \(\newcommand{\dvec}{\mathbf d}\) \(\newcommand{\dtil}{\widetilde{\mathbf d}}\) \(\newcommand{\evec}{\mathbf e}\) \(\newcommand{\fvec}{\mathbf f}\) \(\newcommand{\nvec}{\mathbf n}\) \(\newcommand{\pvec}{\mathbf p}\) \(\newcommand{\qvec}{\mathbf q}\) \(\newcommand{\svec}{\mathbf s}\) \(\newcommand{\tvec}{\mathbf t}\) \(\newcommand{\uvec}{\mathbf u}\) \(\newcommand{\vvec}{\mathbf v}\) \(\newcommand{\wvec}{\mathbf w}\) \(\newcommand{\xvec}{\mathbf x}\) \(\newcommand{\yvec}{\mathbf y}\) \(\newcommand{\zvec}{\mathbf z}\) \(\newcommand{\rvec}{\mathbf r}\) \(\newcommand{\mvec}{\mathbf m}\) \(\newcommand{\zerovec}{\mathbf 0}\) \(\newcommand{\onevec}{\mathbf 1}\) \(\newcommand{\real}{\mathbb R}\) \(\newcommand{\twovec}[2]{\left[\begin{array}{r}#1 \\ #2 \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\ctwovec}[2]{\left[\begin{array}{c}#1 \\ #2 \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\threevec}[3]{\left[\begin{array}{r}#1 \\ #2 \\ #3 \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\cthreevec}[3]{\left[\begin{array}{c}#1 \\ #2 \\ #3 \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\fourvec}[4]{\left[\begin{array}{r}#1 \\ #2 \\ #3 \\ #4 \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\cfourvec}[4]{\left[\begin{array}{c}#1 \\ #2 \\ #3 \\ #4 \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\fivevec}[5]{\left[\begin{array}{r}#1 \\ #2 \\ #3 \\ #4 \\ #5 \\ \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\cfivevec}[5]{\left[\begin{array}{c}#1 \\ #2 \\ #3 \\ #4 \\ #5 \\ \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\mattwo}[4]{\left[\begin{array}{rr}#1 \amp #2 \\ #3 \amp #4 \\ \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\laspan}[1]{\text{Span}\{#1\}}\) \(\newcommand{\bcal}{\cal B}\) \(\newcommand{\ccal}{\cal C}\) \(\newcommand{\scal}{\cal S}\) \(\newcommand{\wcal}{\cal W}\) \(\newcommand{\ecal}{\cal E}\) \(\newcommand{\coords}[2]{\left\{#1\right\}_{#2}}\) \(\newcommand{\gray}[1]{\color{gray}{#1}}\) \(\newcommand{\lgray}[1]{\color{lightgray}{#1}}\) \(\newcommand{\rank}{\operatorname{rank}}\) \(\newcommand{\row}{\text{Row}}\) \(\newcommand{\col}{\text{Col}}\) \(\renewcommand{\row}{\text{Row}}\) \(\newcommand{\nul}{\text{Nul}}\) \(\newcommand{\var}{\text{Var}}\) \(\newcommand{\corr}{\text{corr}}\) \(\newcommand{\len}[1]{\left|#1\right|}\) \(\newcommand{\bbar}{\overline{\bvec}}\) \(\newcommand{\bhat}{\widehat{\bvec}}\) \(\newcommand{\bperp}{\bvec^\perp}\) \(\newcommand{\xhat}{\widehat{\xvec}}\) \(\newcommand{\vhat}{\widehat{\vvec}}\) \(\newcommand{\uhat}{\widehat{\uvec}}\) \(\newcommand{\what}{\widehat{\wvec}}\) \(\newcommand{\Sighat}{\widehat{\Sigma}}\) \(\newcommand{\lt}{<}\) \(\newcommand{\gt}{>}\) \(\newcommand{\amp}{&}\) \(\definecolor{fillinmathshade}{gray}{0.9}\)La espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) permite medir las propiedades difusivas de las moléculas fluorescentes, y está estrechamente relacionada con el FRAP. En lugar de medir los perfiles de concentración dependientes del tiempo y modelar la cinética como difusión continua, el FCS sigue las fluctuaciones de estado estacionario en la densidad numérica de una molécula sonda fluorescente muy diluida en el pequeño volumen observado en un microscopio confocal. Medimos los cambios fluctuantes en la intensidad de fluorescencia emitida por las moléculas de sonda a medida que se difunden dentro y fuera del volumen focal.
- Concentración promedio de la muestra: C 0 = <10 —9 M — 10 —7 M.
- Esto corresponde a un promedio de ~0.1-100 moléculas en el volumen focal, aunque este número varía con la difusión dentro y fuera del volumen.
- La trayectoria de fluorescencia fluctuante es proporcional a la
densidad o concentración numérica dependiente del tiempo:
\[ F(t) \propto C(t) \nonumber \]
- ¿Qué tan grandes son las fluctuaciones? Para un proceso aleatorio gaussiano, esperamos\(\dfrac{\delta N_{rms}}{N} \sim \dfrac{1}{\sqrt{N}} \)
- La concentración observada en cualquier momento puede expresarse como
fluctuaciones dependientes del tiempo alrededor de un valor promedio:\(C(t) = \overline{C} + \delta C(t)\).
Para describir lo observable experimental, se modela la dependencia temporal de ΔC (t) a partir de la ecuación de difusión:
\[ \dfrac{\partial \delta C}{\partial t} = D \nabla^2 \delta C \nonumber \]
\[ \langle \delta C(r,0) \delta C(r',t) \rangle = \dfrac{C_0}{(4\pi Dt)^{3/2}} e^{-(r-r')^2/4Dt} \nonumber \]
Las fluctuaciones de concentración pueden estar relacionadas con las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia como
\[ F(t) = AW(r) C(r,t) \nonumber \]
W (r): Perfil óptico espacial de excitación y detección
A: Otros parámetros experimentales de excitación y detección
Calcular la función de correlación FCS para fluctuaciones de intensidad de fluorescencia. \(F(t) = \langle F \rangle -\delta F(t) \)
\[ G(t) = \dfrac{\langle \delta F(0) \delta F(t) \rangle}{\langle \delta F \rangle^2} \nonumber \]
Para el caso de una viga gaussiana con una talla de cintura w 0:
\[ G(t) \sim \dfrac{B}{1+t/\tau_{FCS}} \nonumber \]
Donde está la amplitud\(B = 4\pi A^2I_0^2\overline{\delta C^2_0} w_0^2\), y el tiempo de correlación se relaciona con la constante de difusión por:
\[ \tau_{FCS} = \dfrac{w_0^2}{4D} \nonumber \]
___________________________________
Lecturas
- P. Schwille y E. Haustein, “Espectroscopia de correlación de fluorescencia: una introducción a sus conceptos y aplicaciones” en el libro de texto de biofísica en línea.